同济学霸带你深度解读这篇9.58分的SCI文章！
作者简介
本文作者通通，临床医学学硕，对文献阅读有一定心得体会，后续将会带来一系列医学文献分享，和大家一起理清文献思路，克服文献阅读过程中的障碍，让阅读文献成为一种乐趣。
文献简介
二甲双胍，一种耳熟能详的降糖药物，近年来不断被发现具有降糖外效应——减肥、抗癌、防衰老、抗氧化等。今天给大家分享的一篇文献于近期发表于PNAS（IF=9.5），研究者通过临床病例回顾性分析和细胞动物实验，发现了二甲双胍抑制转移性结直肠癌的新机制。
Metformin selectively inhibits metastatic colorectal cancer with the KRAS mutation by intracellular accumulation through silencing MATE1
DOI：10.1073/pnas.1918845117
背景知识
结直肠癌是全世界范围内高发肿瘤之一，常伴有KRAS基因突变，致使肿瘤增殖、转移能力增强，并常常发生耐药，患者预后很差。目前已有的研究表明，二甲双胍能够对多种癌症起到抑制效果。然而，这其中的分子机制至今尚不完全明确，且不同的研究结果之间还有矛盾之处。前期有研究人员发现，二甲双胍并不能改善结直肠癌患者的预后，至于背后的原因，并未有明确的解释；而且有关二甲双胍对伴有KRAS基因突变转移性结直肠癌（mCRC）的影响，目前也缺乏有力的证据。所以本文研究者就聚焦于此，力求明晰二甲双胍对mCRC的影响及作用机制。
本文概览
我们首先看文章题目，找出其中几个关键词：沉默MATE1表达、胞内聚积、二甲双胍、选择性抑制、转移、伴有KRAS突变的结直肠癌，由此可总结出本文科学假设：在伴有KRAS突变的结直肠癌中，通过沉默MATE1表达，二甲双胍聚积于细胞内，发挥癌症抑制作用。
再结合摘要部分，我们可以总结出本文研究的主要内容：
在伴有糖尿病的KRAS突变mCRC患者中，相较于其他降糖药，服用二甲双胍者具有更长的生存期；
在无KRAS突变的mCRC患者中，服用二甲双胍不能延长生存期；
二甲双胍能够在具有KRAS突变的mCRC肿瘤细胞和组织中聚积，在非KRAS突变mCRC肿瘤细胞和组织中无此现象；
在机制方面，KRAS突变通过上调DNMT1，使肿瘤细胞中MATE1基因（二甲双胍清除泵）过度甲基化，从而表达沉默，导致二甲双胍聚积于细胞内。
研究内容
KRAS突变增强二甲双胍对mCRC的抑制作用
关于二甲双胍对结直肠癌患者预后的影响，前人的研究结果出现了矛盾之处，所以研究者首先就是要明确二甲双胍对结直肠癌患者的作用效果。
临床病例回顾性分析
首先，研究者收集了2335名mCRC患者的临床病例，其中包含282例合并有糖尿病的患者。通过回顾性分析发现了一个有趣的结论：与不伴有糖尿病的mCRC患者相比，合并糖尿病者如果服用二甲双胍会明显延长生存期（也就是说糖尿病带来的不良影响可被二甲双胍所纠正，而且纠正效果竟然还优于无糖尿病组），而其他降糖药物达不到此效果。这就表明，二甲双胍能够起到抗癌效应，而且这种效应与其降糖作用无明显联系。
接下来，研究者把伴有糖尿病的mCRC患者分为两组：服用二甲双胍组（109例）和服用其他降糖药物组（141例），然而在校正各种混杂因素后并没有发现二甲双胍能够改善患者总生存期或者无进展生存期。这是为什么呢？研究者假设二甲双胍的抗癌效果可能存在个体差异性。所以接下来就进行亚组分析，当以KRAS是否突变为分组依据时，观察到了二甲双胍对KRAS突变患者预后的显著改善作用（分别延长总生存期37.8个月和无进展生存期8.1个月）；而且还检测到二甲双胍对KRAS突变mCRC组织具有明显的增殖抑制作用。
动物和细胞实验
以上结果提示二甲双胍可能对伴有KRAS突变的mCRC患者更为有效。为了提供进一步的证据，研究者继续进行动物和细胞实验。在动物实验中，研究者建立了移植瘤小鼠模型，分别来源于KRAS突变患者肿瘤细胞和正常KRAS肿瘤细胞。在经二甲双胍处理后，发现：二甲双胍能够显著抑制伴有KRAS突变小鼠中肿瘤的生长和增殖，而在非KRAS突变小鼠中无此作用。
接下来，研究者又选取了多株KRAS突变型（HCT-16、LoVo、SW480、SW620）和非突变型（SW48、CaCO2）CRC细胞，发现二甲双胍能以剂量依赖方式显著抑制KRAS突变细胞生长，而对非KRAS突变的细胞无抑制作用。而且，如果在无突变细胞中过表达突变型KRAS，可恢复二甲双胍对其的生长抑制能力；反过来，在突变型mCRC细胞中阻断突变KRAS表达，抑制效应则不再出现。
二甲双胍通过失活RAS/ERK、AKT/mTOR通路抑制KRAS突变型CRC细胞的增殖
**前面观察到二甲双胍能够减少KRAS突变型CRC细胞数目，为什么呢？**这里我们可以想到两个原因：
① 死亡增加；
② 增殖减慢。
研究者也即针对这两方面进行检测，发现二甲双胍对细胞凋亡并没有显著影响，而是通过停滞细胞周期发挥抑制生长、增殖的作用。
上述结果观察到细胞周期在G1期发生了停滞，而RAS/ERK、AKT/mTOR是对此进行调节的关键细胞信号通路，所以研究者就对这两条通路的活性进行了检测。结果显示，这两条通路（包括其下游调节细胞周期的关键分子RB和4E-BP1）的活性均被二甲双胍所抑制。
KRAS突变促进二甲双胍在mCRC组织和细胞中聚积
看到这里，我们会想到一个问题，为什么二甲双胍对非KRAS突变的CRC细胞无增殖抑制作用？接下来研究者就针对这一疑问展开研究。有研究表明，二甲双胍要在高剂量服用时才能表现出与结直肠癌患者死亡率的显著相关性，前述实验结果也说明二甲双胍浓度越高，对细胞增殖抑制效应越明显。所以研究者就假设二甲双胍对肿瘤细胞的抑制作用与细胞内药物浓度相关。
针对这一假设，我们要如何做呢？很简单，在维持给药浓度不变的情况下，减少二甲双胍进入细胞就行了。果然，如果抑制转运蛋白OCT，即使是KRAS突变的mCRC细胞，其对二甲双胍的敏感性也会降低。
那KRAS是否突变对细胞内二甲双胍浓度有什么影响呢？从下图我们可以看出：KRAS突变使二甲双胍在mCRC细胞和组织中的浓度显著增加。
二甲双胍最适宜的血浆浓度在10~40uM之间，相比于上述实验，这个药物浓度非常低。但临床上患者并不需要每次服用太多剂量，他们需要做到长期服用，那这种长期低浓度药物暴露会不会有抗癌效果呢？通过下图我们可以看到，低浓度持续给药仍可导致二甲双胍聚积于KRAS突变CRC细胞中，从而发挥抗肿瘤作用。
KRAS突变通过上调DNMT1，促进MATE1启动子甲基化，沉默其表达，进而减少细胞对二甲双胍的清除
在KRAS突变CRC细胞中，MATE1表达降低
从前面的结果中，我们可以知道为什么二甲双胍仅抑制KRAS突变CRC细胞的增殖了：因为KRAS突变导致二甲双胍在肿瘤细胞中大量聚积。但为什么会出现这种现象呢？
要解决这个问题，我们可以去检测细胞对二甲双胍的吸收和清除能力是否有改变。
为此，研究者检测了6个细胞中的二甲双胍通道蛋白，发现在KRAS突变mCRC细胞中，介导二甲双胍清除的MATE1蛋白（由SLC47A1基因编码）表达显著下调，其表达水平与细胞增殖能力呈正相关。
进而通过对突变型KRAS的过表达和沉默实验，说明了过表达突变型KRAS增加MATE1水平，沉默KRAS会降低。另一方面，如果过表达MATE1，则会减弱二甲双胍对KRAS突变CRC细胞的抑制，沉默MATE1会增加非KRAS突变CRC细胞对二甲双胍的敏感性。
进一步，为了证实MATE1在二甲双胍发挥抗癌效应中的作用，研究者继续使用PDX动物模型进行探究，实验分为四组：非KRAS突变组、非KRAS突变+MATE1敲除组、KRAS突变组、KRAS突变+MATE1过表达组，结果表明：在KRAS突变CRC小鼠中，MATE1低表达对于二甲双胍发挥增殖抑制作用是必需的。
KRAS突变上调DNMT1表达，进而使MATE1启动子过度甲基化，诱发表达沉默
是什么原因引起的MATE1表达沉默呢？已经知道MATE1启动子中有两个富含甲基化位点的区域（CpG岛，通过TCGA数据库分析，发现此位点被甲基化后转录受抑制），研究者就想明确此区域的甲基化状态。通过检测，发现在KRAS突变CRC细胞中，MATE1启动子甲基化水平显著增加，进而转录受抑制、蛋白表达减少。
那么问题又来了，为什么MATE1启动子甲基化水平会增加？依然考虑两个原因：① 甲基化过程增加；②去甲基化过程受抑制。通过检测细胞内甲基化和去甲基化相关酶的表达，研究者发现在CRC组织和细胞中，KRAS突变会使DNA甲基化酶DNMT1表达水平显著增加，而去甲基化酶无明显变化。
研究总结
研究内容至此结束，我们结合这张图来作一总结：研究者通过前人的矛盾研究结果，结合自己的临床病例分析，发现二甲双胍只是对结直肠癌中的一类——伴有KRAS突变的转移性结直肠癌具有抑制作用。为什么具有这种选择性？因为KRAS突变使细胞内DNA甲基化酶表达上调，进而使MATE1启动子甲基化，表达受抑制。**而MATE1使细胞排出二甲双胍的关键蛋白，其表达降低致使二甲双胍聚积于细胞内，**进一步通过失活RAS/ERK、AKT/mTOR两条通路，调节细胞周期，使其发生停滞，发挥抑制细胞增殖的作用。
在本研究中，二甲双胍是关注的主变量，首先明确其对结直肠的影响；然后寻找产生这种影响的原因，研究者着重关注了上游机制，即二甲双胍为什么会聚积在细胞内，一步步抽丝剥茧，发现了“KRAS突变——DNMT1上调——MATE1表达沉默——二甲双胍聚积”这一调节轴；而在二甲双胍下游机制的探究中，研究者就做的相对比较简单，只是对两条通路进行检测，发现了二甲双胍可以通过停滞细胞周期而抑制细胞增殖。
理清文章中的论证逻辑，本文也就不再难理解了！同时这篇文章也告诉我们，即使是像二甲双胍这么此古老的一个药物，只要在实际中注意观察，也可以找到新的研究方向，做出高质量的研究！