组织学技术 火棉胶包埋切片、火棉胶石蜡双重包埋
一、火棉胶包埋切片
火棉胶(Collodion)是火棉溶于乙醚酒精的浆胶。分干片和溶液两种。均属易燃品,应绝对避火。有两种形态:透明的块状物;絮状物。用时防吸水。有少量水分渗入即呈乳白色。
配制方法:称火棉胶4~5克、10克及15·20克,分别溶解于乙醚酒精(1:1)中。也可将火棉胶溶于无水酒精后再加等量的乙醚。存放于棕色的双瓶盖(一盖一塞)玻璃瓶,经常摇动。
(一)浸胶、包埋
组织块固定、脱水后,经无水酒精乙醚混合液透明,入4~5%火棉胶液、10%火棉胶液和15~20%火 棉胶液 浸胶处理。2*3*3毫米的组织,每级2天左右;3*5*5毫米组织,则需5~7天。再大的组织,所需时间更长,如人脑和胎儿整体标本,需半年以上。
火棉胶包埋的组织收缩较少,较大或较硬的组织或器官更易制作切片,如大脑、小脑、脑干,及易塌陷的器官如眼球、内耳等,均能得到满意的结果。
但火 棉胶包埋的缺点是浸胶很慢;难以制作较薄的切片'很难连续切片。
包埋过程:
⑴准备好木托,略大于组织块,外用内面涂有薄层凡士林的薄纸包成方筒形,托底的纸折叠封闭,避免火棉胶漏出。
⑵倒入切片用的火棉胶15~20%(较厚切片可用10%左右),在底部垫一小片用过的火棉胶块或其它切过的组织。
⑶入已浸好的组织块,切面方正。夹组织时,把长镊沾乙醚酒精 再夹组织,避免沾上过多的火棉胶,并用长镊将组织块放在垫的火 棉胶片上。
⑷确保火棉胶液盖满组织块。
⑸将包埋块(纸筒及组织托火棉胶块)放入小烧杯内。封于空的干燥器内(放有少量约5毫升乙醚)。一定时间后,火棉胶内的气泡上升至表面。
⑹打开干燥器的盖子,使残存的乙醚逸出。
⑺硬化火棉胶。将纯争 的氯仿倒入盛有组织托的小烧杯内(约五分之一),组织托底部放在盛氯仿的小烧杯内(托在下,组织 上)。
⑻盖上干燥器的盖子,并用凡士林封盖口。静置一天再开盖检查。如硬度不够,换新的氯仿或将组织托倒置于氯仿的烧杯内再放1~2天。
⑼夏天避免阳光直晒或室温过高。
⑽硬度以手指压后不出现指纹为宜。大块组织用10%火棉胶包埋。火 棉胶浓度高(20%),组织块小,较易制成薄片,甚至10微米的切片。
⑾已硬化的组织手连同底托(可剥去包的纸壳)放入70%酒精 内暂存。
附:加温包埋法
⑴ 70%酒精 2次 各30分钟 56 ℃温箱
⑵ 80%酒精 2次 各30分钟 56 ℃温箱
⑶95%酒精 2次 各30分钟 56 ℃温箱
⑷无水酒精 2次 各30分钟 56 ℃温箱
⑸乙醚酒精 1次 1小时 56 ℃温箱
⑹5%火棉胶液 1次 1小时 56 ℃温箱
⑺10%火棉胶液 1次 1小时 56 ℃温箱
⑻15~20%%火棉胶液 1次 12~24小时 56 ℃温箱
注意:防火 棉胶挥发;防燃爆。容器(瓶)要结实,瓶塞(盖)要牢固。
(二)火棉胶切片
在滑动切片机轨道上滴加液体石蜡或润油,使刀台和工作台能顺利运行。切片刀锐利,角度10度 以内。切片刀凹面向上,保留一些酒精,使切片易于平展于刀体上。
将火棉胶块固定在工作台上,调整方位,并将切片刀位置推到切片机远端,调整切片厚度,再将切片刀由远端向近端拉回,刀刃与组织接触时速度均匀,不可太快和加压力。最好是组织的一角先与刀刃接触,切后将切片用毛笔从切片刀上取下并保存于70%酒精内。
火棉胶切片常在切口处卷成卷,应在该片未切完前用毛笔将卷起的切片 切片刀上摊平,再将奉命部分切下。
中途停止切片,将切片刀了下,用酒精擦净后再涂少许油脂避免生锈。组织了下放入70%酒精 或酒精棉球覆盖,不能让火棉胶块干燥。切片后将切片机各处残留的酒精擦净并加油。
(三)火棉胶贴片
一般采取游离染色法:漂浮染色。
需粘片则用下列方法。
⒈蛋白甘油粘片法:将切片放在薄涂蛋白甘油的载玻片上,用滤纸沾干。加丁香油数滴,静置数分钟,再用滤纸沾去丁香油,经95%酒精及蒸馏水冲洗,即可染色。
⒉ 明胶粘片法:取明胶4克溶于冰醋酸20毫升,于65~70C水浴内加温溶化,加70%酒精70毫升及5%铬矾水溶液1~2毫升。将此液滴在载玻片上,干燥,形成一层明胶薄膜。遇水时明胶膜稍有溶化即产生一定粘性,将切片放上粘牢。
⒊火棉胶粘片法:切片从70%酒精移到载玻片上,用细针展平,滤纸吸干,在切片上薄涂0.5%火棉胶液,蒸馏水洗后染色。
二、火棉胶石蜡双重包埋
(一)苯甲酸甲酯火棉胶石蜡包埋法
⑴组织块固定水洗后,转入50%酒精、70%酒精、90%酒精脱水各2小时。
⑵无水酒精脱水2~16小时。
⑶苯甲酸甲酯火棉胶液24小时、48小时、72小时。
将固态火 棉胶1克溶于苯甲酸甲酯(Methyl benzoate)100毫升,不断摇动玻璃瓶使其完全溶解
⑷苯甲酸甲酯三次共4~12小时。
⑸等量苯甲酸甲酯石蜡液1小时。
⑹浸蜡两次,0.5~6小时(组织厚度。5毫米厚需3小时)
⑺常规硬蜡包埋。
(二)二氧陆环火棉胶石蜡包埋法
⑴组织块固定水洗,入二氧陆环(1,4-Dioxane)2小时。
⑵ 二氧陆环火 棉胶液3天。
⑶二氧陆环70毫升,2%火棉胶30毫升
⑷二氧陆环2小时。
⑸二氧陆环-石蜡(1:1)2小时。
⑹浸蜡3次:20分钟、30分钟、60分钟。
⑺常规石蜡包埋。
(三)火棉胶石蜡包埋法
⒈浸火棉胶:
⑴常规经各级酒精脱水,
⑵转入等量乙醚酒精透明(组织块大小),
⑶转入2~4%稀火棉胶液各36~48小时。
⒉用氯仿蒸汽硬化火棉胶块:
将浸胶的组织块转入无盖培养皿中,并向培养皿倒入相同浓度的稀火棉胶液,稍淹过组织块,将此培养皿连同装有氯仿的培养皿或小广口瓶一道放入干燥器内,加盖密封,放1~2小时,将火棉胶块翻转,再硬化1小时。火棉胶块完全硬化。
⒊修切火 棉胶块:
从培养皿中取出胶块,用解剖刀将其四周的火棉胶层修去,尽量接近组织。
⒋氯仿透明火棉胶块:
将修切的胶块逮入氯仿中24小时,换3次氯仿。将火棉胶组织块中的乙醚酒精全部排除,胶块在氯仿中下沉。
火棉胶块透明:苯透明;氯仿透明后用苯透明;氯仿透明。
⒌浸蜡:
当入熔点42~46℃软蜡2~#小时,再浸硬蜡30分钟 。
⒍包埋:
常规石蜡包埋。
注意事项:
①火棉胶浓度:2~4%;②氯仿透明:宜长不宜短,可长达48小时;③浸蜡时间:浸软蜡时间适当延长,48℃石蜡3小时,浸硬蜡30分钟不超过60分钟。
三、火棉胶切片苏木精伊红染色法
火棉胶切片不需将火棉胶溶去。从70%酒精取出,用蒸馏水洗即能染色。
染色后经各级酒精上行于95%酒精 ,用石炭酸(Carbolic acid)二甲苯或木馏油(Creosotum)二甲苯脱水、透明,用二甲苯洗两次洗净石炭酸。移至载玻片上,滴加树胶封固。
若火棉胶粘片,其脱水方法与石蜡切片相同。
⑴ 苏木精染色(如Delafield苏木精、Ehrlich苏木精、Hansen苏木精、Harris苏木精、Mayer苏木精)5~15分钟。(Zenker液固定的组织,染色时间加长)
⑵自来水洗去多余的染料。
⑷入0.5~1%盐酸70%酒精溶液或水溶液分色至核于红紫色、胶原纤维和肌组织及细胞质自来水洗或氨酒精至细胞核呈蓝色。
⑸蒸馏水洗去氨水。
⑹0.5~1%伊红水溶液或95%酒精 染数秒至数分钟。
⑺自来水洗去多余伊红染料,蒸馏水洗净。
⑻95%酒精 分色至胞浆、结缔组织等呈桃红色。
⑼95%酒精一次。
⑽无水酒精 脱水。
⑽冬青油透明,不必加盖玻片即可镜检;染色满意后,经两次二甲苯透明几分钟。
⑾取出切片,将组织周围多余的二甲苯擦去,滴加树胶加盖玻片封固。
四、火棉胶石蜡双重包埋切片苏木精伊红染色法
与石蜡切片染色相同。
⑴ 切片粘于载玻片上,烘干。
⑵二甲苯两次将硬蜡脱净。
⑶经无水酒精及各级酒精下行至水。
⑷蒸馏水或自来水略洗。
⑸苏木精染色(如Delafield苏木精、Ehrlich苏木精、Hansen苏木精、Harris苏木精、Mayer苏木精)5~15分钟。(Zenker液固定的组织,染色时间加长)
⑹自来水洗去多余的染料。
⑺入0.5~1%盐酸70%酒精溶液或水溶液分色至核于红紫色、胶原纤维和肌组织及细胞质自来水洗或氨酒精至细胞核呈蓝色。
⑻蒸馏水洗去氨水。
⑼0.5~1%伊红水溶液或95%酒精 染数秒至数分钟。
⑽自来水洗去多余伊红染料,蒸馏水洗净。
⑾ 95%酒精 分色2次 至胞浆、结缔组织等呈桃红色。
⑿无水酒精 脱水两次。
⒀冬青油透明,不必加盖玻片即可镜检;染色满意后,经两次二甲苯透明几分钟。
⒁取出切片,将组织周围多余的二甲苯擦去,滴加树胶加盖玻片封固。
结果:细胞核蓝色、紫色至黑色;胶原纤维、肌纤维、嗜酸性颗粒桃红色;细胞浆桃红色;弹性纤维明亮桃红色。