汤亭亭教授：骨修复材料如何满足高感染风险骨缺损修复的需求
引言
整理：杨超
汤亭亭教授
照片来源：Regenovo
临床上开放性损伤有很高的细菌感染风险。对于闭合型骨折来说，如果是粉碎性的，感染并发症的几率大概在3%-8%左右；而如果合并开放伤口，感染的发生率可高达20%。
目前，临床上对于低感染风险的骨缺损，可直接进行一期修复；而对于高感染风险骨缺损一般采取两期手术的方法。首先是进行清创，之后给予全身或局部的抗生素来控制感染。等感染完全控制以后，进行二期的植骨和修复。无论是一期还是二期修复，植骨替代材料本身容易成为细菌附着的良好载体，增加感染发生的风险。据研究，和无植入物存在时比较，材料植入体内后，少1万倍的细菌即可形成感染。
当骨修复材料植入体内后，周围的干细胞也会长入载体内部，在材料表面黏附增殖并最终分化成骨。但如果体内有细菌存在，就会和成骨细胞竞争黏附有限的材料表面。成骨细胞和细菌竞争性黏附的时间一般是6个小时，6个小时后，一旦细菌占据了材料表面，成骨细胞就很难有附着的机会。
细菌黏附到材料表面后会形成膜状结构，叫做生物膜。生物膜其实是细菌以及它产生的细胞外基质，主要是多糖和蛋白质形成的复合结构，它能够将细菌包裹，使抗生素很难渗透到内部杀死细菌。
我们希望利用3D打印的方法制备一个兼具抗菌和骨传导活性的骨修复支架。不但可以发挥骨传导的性能，而且可以阻止细菌的黏附和感染的发生。
含镁支架的抗菌效应研究
含镁支架是利用低温3D打印技术制备的含有镁的PLGA/TCP支架材料。这个支架材料的孔隙率为50%-60%左右，孔径在300-450微米左右，具有比较好的力学强度。支架是由深圳先进研究院的秦岭教授团队制备的，他们之前的研究已表明这种支架具有很好的成骨活性。我们与秦教授团队合作，对含镁支架的抗菌效应进行了评价。
我们做了6小时细菌黏附情况的实验，与普通的支架材料相比，含镁15%、10%和5%的三种支架都可以明显地抑制细菌的黏附。考虑到细菌的生长是非常快的，短期六小时的评价不能完全反映含镁材料的抗菌效应，因此我们又做了一天和两天的实验，观察细菌的定植和生物膜形成的情况，同样发现含镁支架可以明显地抑制细菌的增殖和生物膜形成，并且抑菌效率和镁含量的升高正相关。
到底是哪几个因素造成了含镁支架的抗菌效应？我们通过降解实验发现，随着材料的降解，镁离子的含量、pH值、渗透压都发生了变化。然后我们又通过调整pH值、镁离子含量和渗透压的方法进行分析，发现镁离子本身不具备明显的抗菌效应，渗透压对细菌的生长也没有明显影响，是pH值的升高形成的碱性环境抑制了细菌生长。
对于支架材料来说，细胞的相容性是非常重要的，我们探究了含镁支架对前成骨细胞生长的影响，发现镁离子含量为5%和10%的支架有很好的细胞相容性。但是15%的镁含量在一定程度上抑制了细胞的生长，所以抗菌效应与成骨细胞的相容性往往是互相矛盾的。我们需要找到一个窗口，既可以抑制细菌的生长，又可以很好地促进成骨细胞的黏附。
新型抗菌材料——壳聚糖季铵盐
由于镁本身不具备杀菌能力，主要是通过pH值升高形成的碱性环境抑制细菌生长，因此作为治疗性使用的效力可能不够。于是，我们研究了新型的抗菌材料——壳聚糖季铵盐。壳聚糖是天然的阳离子多糖，表面带正电荷，可以和表面带负电荷的细菌的细胞壁结合，阻止营养物质的渗透造成细菌的死亡。但天然的壳聚糖在中性和碱性条件下非常难溶解，限制了抑菌能力的发挥。通过季铵化以后的壳聚糖，水溶性和抗菌性能都有明显的增强，抗菌效能明显优于普通的壳聚糖和单独的季铵盐。
此外，生物膜形成实验发现，随着壳聚糖季铵盐取代度的升高以及浓度的升高，对细菌的杀伤能力随之增强。但在生物膜形成以后，只有非常高的取代度和非常高的浓度才可以杀死生物膜内的细菌，因此预防生物膜的形成比形成生物膜以后再开始治疗更重要。
同样我们分析了壳聚糖季铵盐和成骨细胞的相容性。我们发现季铵化取代度太高会产生一定的细胞毒性。因此，我们认为中等取代度的壳聚糖季铵盐同时具备良好的抗菌性能和成骨细胞的相容性。
之后，我们把这样一个材料接枝到3D打印骨传导支架的表面，并且希望这个表面具有选择性的毒性，即只对细菌产生毒性，而对成骨细胞有很好的相容性。
我们采用PLGA/HA（羟基磷灰石）这样一个体系，利用3D打印的方法制备多孔支架，再在支架的表面接枝壳聚糖跟季铵盐。和对含镁支架的评价一样，我们观察了骨科临床常见的致病菌，包括金黄色葡萄球菌、表皮普通球菌以及耐药的细菌，在支架表面的黏附和生物膜形成情况。结果发现接枝壳聚糖季铵盐的3D打印支架可以很好抑制细菌在支架内的生长。
此外，我们还做了体内的评价，采用带荧光素酶的细菌，支架接种细菌后皮下植入，通过活体荧光成像系统实时定量观察了细菌在支架内部生长的情况。4周后，我们再将支架拿出来做培养，看看有没有残留细菌的生长，并通过组织学观察局部感染和炎症的表现。结果证实，接枝了壳聚糖季铵盐的3D打印支架在体内可以很好地预防感染的发生。
结论
从这些研究可以得出这样的结论：通过复合镁、或接枝壳聚糖季铵盐的方法，可以赋予3D打印骨修复支架材料良好的抗菌性能。3D打印技术也可以将生长因子或抗生素复合到材料内部，并通过对周围环境的相应来实现药物的控制释放，满足临床上对骨修复及抗菌的双重需求。
第一届Regenovo生物3D打印学术论坛由浙江省医学信息与生物三维打印重点实验室主办；杭州捷诺飞生物科技有限公司承办；火石创造媒体支持。