月旭炼金术士教您如何选择缓冲盐

各位小伙伴在做方法开发时，缓冲盐是经常会使用到的一类试剂，那么小伙伴们对缓冲盐了解多少呢，我们该如何选择合适的缓冲盐呢，这里就让小编给各位小伙伴们讲解一二。

什么时候需要缓冲盐？

在反相色谱分析中，流动相的pH值一般在2-7之间，当分析物在反相条件下可解离，或样品的pH值在2－7之外时，就需要缓冲盐，在反相条件下可解离的化合物一般有氨基和羧基，他们的pKa在1－11之间，选择正确的缓冲液pH值可保证解离的官能团处于一种形式，离子形式或中性化合物的形式；如果样品的pH值对柱子有伤害，则缓冲溶液可使其变温和或减小其危害，常规硅胶基质色谱柱的pH耐受范围2-8。

常见缓冲盐分类

碱类

碱类添加剂常见的是氨水和三乙胺，两者都能让水的pH到达非常高的水平，高到能把硅胶颗粒溶解掉，要慎用，另外就是这两种溶剂通常不太容易通过冲洗维护的方式清除掉。尤其是三乙胺，即使是色谱纯，放的久了也可能会由于变质导致污染。

酸类

甲酸：通常使用的浓度在1%以下，能够让水的pH达到二点几的级别。

乙酸：酸性比甲酸略弱，通常使用浓度不超过5%，能够使水的pH到达到二点几的级别。

三氟乙酸：比较强的酸，使用浓度通常不超过0.5%，能使水的pH达到2以下，具有很大的离子强度及一定的离子对作用，是分析蛋白/多肽时常用的添加剂。以上三种酸最致命的问题在于低波长下的紫外吸收，通常不建议在小于215nm波长的情况下使用，另外就是甲酸/乙酸还有比较大的挥发性，时间久了浓度会发生变化。

磷酸：这是一种不具有挥发性的酸，离子强度也不错，最重要的是，它在低波长紫外区无本底吸收，但是它也存在不少缺点，比如不能兼容质谱方法。

除此之外，还有一些其他的酸，比如硫酸，盐酸或者柠檬酸，但是都是非常罕见。

盐类

相比单纯的酸碱，根据不同缓冲盐中两种盐的配比，可以很容易的配置出一定pH的缓冲溶液，具有缓冲能力的盐类可以很好的控制流动相的pH值。

甲酸盐：通常在液相色谱中常用的甲酸盐都是甲酸铵，这类盐的溶解度好，完全兼容液质联用的方法，对色谱柱的伤害也比较小，但是缺点是离子强度比较低。另外就是甲酸盐比较容易潮解，称量的时候比较困难，在流动相里还可能挥发。

与甲酸配合，可以得到甲酸-甲酸铵缓冲体系，大概缓冲能力在pH3～4.5的范围之内，只要调节两者浓度的比例即可。

乙酸盐：常见为乙酸铵。在使用上，和甲酸盐十分类似，离子强度也不高，与乙酸配合的乙酸-乙酸铵缓冲体系pH的控制能力在pH4～5.5左右。

磷酸盐：是HPLC在紫外检测条件下最常用的缓冲液之一，因为它可以在低于220 nm的波长下使用。磷酸盐具有三个pKa值，可提供pH 1.1-3.1，6.2-8.2，11.3-13.3三个缓冲范围。虽然它使用广泛，但是也要注意它的溶解度问题，防止高浓度条件下在HPLC泵或者色谱柱中析出。

常用的是磷酸的钠盐和钾盐，二者对pH的控制能力十分接近，只是离子强度稍有差异，绝大多数情况下是可以互换使用的，磷酸由于是多元酸，能够形成一氢盐和二氢盐，所以使用磷酸缓冲体系调节pH也是组合比较多，跨度比较大的，并且可以提供较高的离子强度，可惜，磷酸盐流动相体系无法兼容质谱。

以磷酸钠盐为例，可以有以下两种组合的缓冲体系：

磷酸-磷酸二氢钠：pH可以达到1.2～3.1左右的范围。

磷酸二氢钠-磷酸氢二钠：pH可以达到6.5～8左右的范围。

通过样品的pka值选择合适缓冲盐

pH 变化会对不同结构化合物的色谱行为产生不同的影响。中性化合物在反相色谱系统的保留与pH 无关；

酸性化合物在pH 趋于酸性（pH 变小，尤其低于化合物的pka 值）时会因状态趋于中性而增加保留；

碱性化合物在pH 趋于碱性（pH 变大，尤其高于化合物的pka 值）时会因状态趋于中性而增加保留。

反之，高pH 时酸性化合物保留降低；低pH时碱性物质保留会降低。若想获得稳定的保留，对于酸性待测物而言，流动相的pH 值最好低于待测物pka值两个单位；对于碱性待测物来说，流动相的pH值最好高于待测物pka值两个单位。

各位小伙伴想了解更多液相色谱的知识，请咨询月旭当地销售人员或拨打400-810-6969垂询。

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