ELISA检测血清外泌体-癌胚抗原（exo-CEA）
癌胚抗原（CEA）是一种具有人类胚胎抗原特性的酸性糖蛋白，最初发现于结肠癌和胎儿肠组织中，故名癌胚抗原。正常人血清CEA（s-CEA）浓度在5ng/mL以下，CEA升高是一种非特异性肿瘤诊断指标，常见于中晚期结肠癌、胃癌、乳腺癌等；此外长期抽烟的人有可能出现假阳性，因此CEA对肿瘤早期的临床诊断意义不大，多用于健康体检及结肠癌复发的辅助诊断。
结肠癌患者体内肿瘤细胞分泌的外泌体量大大增加，相应的外泌体运载的CEA也会增加，也就是说血清中CEA包括游离CEA（s-CEA）、exo-CEA，但是至于两者各自含量的多少以及对结肠癌诊断价值高低还不清楚。
近日，日本学者Shozo Yokoyama等提出一种简便、灵敏、特异的临床诊断方法-- ELISA检测结肠癌患者血清exo-CEA的含量：发现“血清复融温度、血清外泌体含量、外泌体溶剂成分”等是影响提取exo-CEA产量的关键因素；选取48名发生远处转移的结肠癌患者，检测其体内的exo-CEA，结果表明25°C下exo-CEA对诊断具有较高的准确度，其含量的增加能更有效提示结肠癌远处转移的可能性；此外， 临床检验科采用的s-CEA的cut-off大约为5ng/mL，而该实验数据显示exo-CEA的cut-off为2 ng/mL，提高其诊断的灵敏度（图1）。
图 1 不同cut-off下exo-CEA与s-CEA诊断的灵敏度、特异性、正确度比较
下面，请大家睁大慧眼，跟随本君来欣赏一下该文献吧。
首先，本君为大家捋一捋该实验的思路：该团队选取116名结肠癌患者以及8名健康患者；预实验：提取8名患者和8名健康者的exo-CEA，探究出提取exo-CEA的最优化条件；检测116名患者exo-CEA，比较s-CEA与exo-CEA的准确性、灵敏度及特异性。
1. 血清exo-CEA提取实验条件优化
患者血清保存在-20°C，在提取外泌体之前，需在一定温度下将冷冻血清复融，然后使用ExoQuick试剂盒提取外泌体，最后使用一定组分的重悬溶剂提取外泌体。在此过程中，该团队发现血清复融温度、血清外泌体含量、重悬溶剂成分等是影响exo-CEA产量的关键因素。
1.1 25°C是最佳血清复融温度 （如图2）
该团队采用三个温度复溶冷冻血清：4°C、25°C、37°C；复溶温度对外泌体的提取影响不大（B），但是对exo-CEA的提取影响较大， 25°C是最佳血清复融温度（C）；研究者提出假设：不同温度会影响exo-CEA的抗原性，但尚需进一步的探究。
图 2
A：CD63是一种外泌体标记蛋白，WB实验测定CD63来反映外泌体的有无；
B：8名患者不同复溶温度下血清中外泌体的含量；复溶温度对外泌体的提取
C：8名患者不同复溶温度下血清中exo-CEA的含量；exo-CEA的提取影响较大，25°C是最佳血清复融温度
D：8名健康对照组不同复溶温度下血清中exo-CEA的含量；可以排除假阳性干扰
1.2 1%BSA是最适合的重悬溶剂成分（如图3）
试剂盒提取外泌体最后一步需要使用溶剂将外泌体沉淀重悬，该团队发现1%BSA是最适合的重悬溶剂成分。
图 3 不同重悬溶剂提取exo-CEA含量比较
2. 25°C下exo-CEA对结肠癌远处转移诊断具有较高的准确性（如图4，5）
分析46名患者血清中exo-CEA，比较各个温度下ROC曲线下面积，25°C下exo-CEA对结肠癌远处转移诊断具有较高的准确性（图3）；exo-CEA比s-CEA的临床诊断准确度更高（图4）。
图 4 不同温度下exo-CEA的ROC比较
图 5 exo-CEA与s-CEA的ROC比较
结语：癌胚抗原（CEA）作为一种经典的肿瘤标志物已在临床诊断应用许久，其检测方法包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、电化学发光法等，本次研究者首次利用ELISA检测exo-CEA，并对其实验条件进行优化，初步形成一种简便、灵敏、特异的检测方法，但是该方法还存在一些疑问：如何提高外泌体及exo-CEA纯度，该方法是否适用于其他肿瘤标志物的诊断......路漫漫其修远兮，吾将上下而求索。
参考文献：Clinical implications of carcinoembryonic antigen distribution in serum exosomal fraction—Measurement by ELISA. PLOS ONE；August 17, 2017. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0183337
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