关于肿瘤基因检测和结果解读的几大误区

随着分子医学和靶向药物研究的发展，肺癌的治疗已经进入到个体化治疗的阶段。伴有基因突变的不可手术晚期非小细胞肺癌患者接受TKI靶向药物治疗，其疗效显著优于含铂化疗，能很大程度改善患者的生活质量。

准确地检测出基因突变型或融合是选择合适靶向药物的重要前提，而标本的质量显著影响结果的准确性，标本质量不佳是造成假阴性结果的主要原因，因此在检测前对标本进行质量评估能有效避免这种现象的出现，从而获得准确的检测结果，使患者最大程度受益。

对于肺癌的基因检测目前常用的方法：二代测序 (NGS)、PCR技术、Sanger法、荧光原位杂交 (FISH)等。然而，每种方法各有利弊。

二代测序 (NGS)：单独 NGS 分析并不能检出所有类型的改变，重要的是熟悉单独分析或联合分析可识别的改变类型。对于广泛检测无可识别的驱动癌基因的患者（尤其是从不吸烟的患者），可考虑基于 RNA 的 NGS（如果尚未进行），以最大程度检测融合事件。

PCR可高度针对性地使用（针对特定突变），但该技术只能针对特定的改变进行检测评估。

Sanger测序，要求最大程度的肿瘤富集。未改良的Sanger测序不适合检测富集后肿瘤标本中肿瘤仍不足25%-30%的突变检测。更为重要的是Sanger测序不适于检测识别亚克隆事件（如耐药突变）。

FISH检测主要用于拷贝数、扩增以及结构改变如基因重排等分析检查。

接下来，以肺癌为例对各个靶点进行梳理。

EGFR基因

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EGFR 是一种跨膜酪氨酸激酶受体，该受体激酶域的激活对癌细胞的增殖、生长的相关信号传递，具有重要意义。中国肺腺癌患者EGFR突变率在40-60%，美国患者约10%；但是在纯肺鳞癌中，中美患者突变率＜4%。EGFR中最常见的突变（外显子19 缺失，外显子21中的 p.L858R 点突变），EGFR少见突变约占10%（即外显子 19插入、 p.L861Q、 p.G719X、 p.S768I），其与EGFR 酪氨酸激酶抑制剂 (TKI) 治疗的疗效相关。此外，20外显子插入是突变对多数EGFR-TKI治疗耐药，但是除外以下特例：p.A763_Y764insFQEA 和p. A763_Y764insLQEA 。

对诊断性活检或手术切除标本进行EGFR基因检测，其突变结果可作为ⅡB-ⅢA 期或高危ⅠB-ⅡA 期NSCLC患者的辅助靶向治疗的重要依据。

T790M 是第一代和第二代EGFR-TKI主要的耐药机制，通常情况下对于第三代EGFR-TKI治疗有效。如果在之前没有接受过EGFR-TKI治疗的情况下出现T790M突变，则需要进行遗传咨询和可能的种系基因检测。

对于EGFR突变检测目前常用的方法主要有PCR、Sanger测序和NGS。

ALK基因

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间变性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphomakinase，ALK）基因融合在我国非小细胞肺癌中的发生率约5.6%，其中腺癌的发生率为6.6%-9.6%。伴有ALK基因融合的不可手术晚期NSCLC患者接受 ALK 抑制剂治疗，ORR和PFS 显著优于含铂化疗，并改善患者的生活质量。但是，ALK 基因融合阴性患者并不能从 ALK 抑制剂治疗中获益。建议所有经病理学诊断为肺浸润性腺癌（包括含腺癌成分）患者均需进行ALK基因融合检测。

EML4⁃ALK融合变体亚型目前发现有20余种，其中，最常见的是EML4的变体1［v1：外显子13 与ALK 的外显子20 融合（E13；A20）］和变体3v3a/b［外显子6a/b与ALK 的外显子20 融合（E6a/b；A20）］，这两种变体类型约占总体的 60%。此外，该有TFG、KLC1、SOCS5、H1P1、TPR、BIRC6等基因融合。

目前，ALK常用的检测方法有Ventana⁃D5F3 IHC、FISH、RT⁃PCR、NGS用于ALK 基因融合检测，判读标准参照试剂盒说明书。非Ventana D5F3抗体IHC检测仅用于初筛。

ALK Ventana⁃D5F3 IHC检测方法是目前最快速、经济的方法，且二元结果判读标准简单。但在临床实践中要警惕 ALK Ventana IHC 结果判读中存在的一些陷阱，避免假阳性或假阴性（如富含黏液分泌的肺癌病例）。对于结果不能确定的患者，建议使用其他技术平台进行复检。

FISH检测ALK基因易位是经典的检测方法。但由于EML4⁃ALK易位是倒置易位，有些病例荧光分离信号距离较近，且断裂点附近不稳定，会产生染色体崩塌导致距离更近，加上立体空间位置，可造成假阴性判读结果。对于 FISH信号不典型病例，应推荐其他技术平台进行复检。

ALK Ventana⁃D5F3 IHC检测方法是目前最快速、经济的方法，且二元结果判读标准简单。但在临床实践中要警惕 ALK Ventana IHC 结果判读中存在的一些陷阱，避免假阳性或假阴性（如富含黏液分泌的肺癌病例）。对于结果不能确定的患者，建议使用其他技术平台进行复检。

FISH检测ALK基因易位是经典的检测方法。但由于EML4⁃ALK易位是倒置易位，有些病例荧光分离信号距离较近，且断裂点附近不稳定，会产生染色体崩塌导致距离更近，加上立体空间位置，可造成假阴性判读结果。对于 FISH信号不典型病例，应推荐其他技术平台进行复检。

对于ALK基因检测的标本选择：优先使用肿瘤组织标本。肿瘤组织标本不满足要求时，推荐使用细胞学标本。对于少数客观条件上不能获得组织或细胞学标本的晚期肺癌患者，可尝试血液/脑脊液检测。（如果手术样本保存时间过长（3年以上）、未经过规范化前处理的标本可影响检测结果。）

代表药物：一代 克唑替尼（Crizotinib）、二代 阿来替尼（Alectinib）、塞瑞替尼（Ceritinib）、Brigatinib 、恩沙替尼 ；三代 Lorlatinib。

ROS-1基因

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ROS-1基因作为肺癌驱动基因，其活化要是基因重排所致，常见的融合伴侣包括：CD74、SLC34A2、CCDC6 和 FIG。ROS-1和ALK二者氨基酸序列上具有近49%的相似性，在激酶催化区的ATP结合位点同源性高达 77％。ROS-1融合基因在非小细胞肺癌中的阳性率为1%-3.4%。

关于ROS-1融合基因检测，国际多中心临床研常用FISH或者PCR的方法。常规ROS-1免疫组化可作为初筛方法，但阳性标本须以官方认定批准的PCR的方法 技术或者临床研究使用的FISH方法进一步确诊。FISH方法可能检测不出 FIG-ROS1变异。NGS方法可以检测 ROS1 融合，但基于DNA的 NGS可能无法检出 ROS1 融合。

代表药物：克唑替尼

RET基因

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RET原癌基因位于第10 号染色体长臂（10q11.21），编码一种具有酪氨酸激酶活性的单次跨膜糖蛋白受体，作用于神经胶质细胞胞外信号分子，该类分子隶属神经营养因子家族。RET激酶受体可通过细胞内酪氨酸残基的自磷酸化激活，触

发包括RAS‑MARK、PI3K‑AKT、JAK‑STA、PLCγ等与细胞增殖及存活相关的信号通路。

RET激活主要包括两种改变形式：RET 基因点突变及RET 基因融合。RET 基因点突变常发生于甲状腺髓样癌（MTC），最常见的突变位点是 M918T。RET基因融合变异常见于甲状腺乳头状癌（PTC）、NSCLC，亦可见于结直肠癌、唾液腺癌、卵巢癌等其他多种癌种中。

RET基因融合在NSCLC中发生率仅为1.4%-2.5%，最常见的断裂位点位于第 11 号内含子，部分融合断点位于第 11 号外显子和第 10 号内含子，至今已发现至少 50 余种 RET 融合变体。我国内多中心研究发现，非小细胞肺癌中KIF5B‑RET为最常见的 RET 融合亚型，约占所有 RET 融合的68.3%，其最常见断裂 位 点为 K15∶R12 及 K16∶R12；其次为 CCDC6‑RET（16.8%，常见断 C1∶R12）及 NCOA4‑RET（1.2%）。对于未接受过靶向治疗的人群，RET 融合通常与 EGFR、ALK、ROS1、BRAF 和 METex14跳跃等驱动基因变异相排斥。

目前常见的分子病理检测方法包括免疫组织化学（IHC）、荧光原位杂交（FISH）、即时荧光聚合酶链式反应（RT‑PCR）、二代测序技术等。

IHC检测RET融合其灵敏度50%-100%，特异度 30%-90%，综合评价灵敏度和

特异度，IHC不是作为RET诊断的最佳手段，此外，通过IHC检测确定RET表达量指导临床靶向治疗疗效也存在偏差。目前暂不推荐直接用IHC检测RET基因融合表达。

FISH 检测经典RET融合（KIF5B‑RET，CCDC6‑RET）的灵敏度最高，分别为100%和95%，其他非经典融合如NCOA4‑RET灵敏度仅为 66.7%。在 NGS或 RTPCR 不可及的情况下使用FISH进行检测，或样本量较少或质量不佳时，首选 FISH 检测。

NGS根据检测基因分子的类型不同分为基于DNA水平和RNA水平进行检测RET基因融合。DNA水平检测到部分罕见融合断裂位点可能并不能代表 RNA 水平的融合位点，在极少数情况下，DNA 水平上检测到的基因易位并不会引起融合基因的表达。在进行融合检测时，基于 RNA 的NGS 优于基于 DNA 的NGS。

代表药物：普拉替尼（pralsetinib）、 塞尔帕替尼（selpercatinib）

MET-14基因

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间质-上皮细胞转化因子（MET）基因位于7号染色体（7q31.2）的长臂上，由MET基因编码的蛋白为c-MET，也称肝细胞生长因子受体，属于酪氨酸激酶受体超家族。NSCLC中的MET基因发生异常激活，主要有３种形式：MET-14外显子（MET ex14）跳跃突变、MET基因扩增和蛋白过表达。

MET ex14跳跃突变在NSCLC中占3％-4％ ，在肺肉瘤样癌（PSC）中占较高的比例（4.9%-31.8%），并且在女性和不吸烟者中发生率较高。MET ex14跳跃突变与KRAS、EGFR、ALK和RET等基因变异互斥。

目前用于检测MET ex14跳跃突变的方法包括DNA NGS、外显子14及其两侧内含子的Sanger测序、反转录PCR和基于RNA的NGS检测等。IHC不是检测 MET ex14 跳跃的方法。

代表药物：克唑替尼、卡博替尼、沃利替尼、Tepotinib、Capmatinib

KRAS

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KRAS基因是肿瘤中最常见的突变基因之一, 在我国肺癌患者中KRAS基因突变率约为8%-10%，其主要突变位点在第2号外显子的第12和13密码子，包括 G12C、G12V、G12D、G12F、G12R、G12A、G12S、G13C、G13D 等导致氨基酸替换的突变亚型，以KRAS-G12C最为常见。KRAS 通过下游的 RAF⁃MEK⁃ERK、PI3K⁃AKT⁃mTOR、Ral⁃GEFs等信号通路，参与细胞增殖、侵袭、转移、抗凋亡、血管新生等生物学过程的调节，促进肿瘤的发生发展。

在肺癌中，KRAS 基因往往与其他基因突变共存 ，最常见的共存基因包括 TP53、STK11等。

KRAS-G12C突变多与重度吸烟有关，女性的发病年龄比男性更小、吸烟程度更轻，提示对烟草致癌物的易感性可能更高。。KRAS-G12C突变的患者更易发生骨转移。

KRAS-G12C突变代表药物：AMG 510、MRTX849。

BRAF

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BRAF基因突变主要位于CR3激酶结构域的第11外显子及第15外显子，其中BRAF最常见突变形式为第15外显子的第1,799位核苷酸上T突变为A，导致其编码的缬氨酸变为谷氨酸，即V600E。V600E突变是NSCLC常见的BRAF突变类型，多见于女性、腺癌患者，与预后的关系尚不十分明确。

PCR、Sanger测序和 NGS 是检查 BRAF 突变状态的最常用方法。

BRAF-V600E代表药物：维罗非尼、达拉非尼。

NTRK

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NTRK（NeuroTrophin Receptor Kinase）全称神经营养因子受体络氨酸激酶，包含NTRK1、NTRK2 和 NTRK3，分别编码原肌球蛋白受体激酶（TRK）家族TRKA、TRKB 和 TRKC 三种蛋白。在健康组织中，NTRK通路参与神经系统的发育和功能以及细胞存活，在健康组织中起重要的作用。

NTRK基因家族（NTRK1、NTRK2和NTRK3），任何一个基因如果和其他的基因发生了融合突变，那么就会导致癌细胞异常活性，驱动肿瘤的发生。但NTRK基因融合并不常见，在中国肺癌患者中，NTRK突变小于5%。

目前用于检测NTRK基因融合技术包括FISH、IHC、NGS和PCR检测，其中，NGS二代测序最具优势，但是基于DNA的NGS 可能不能检出NTRK1和NTRK3 融合。

代表药物：拉罗替尼、恩曲替尼

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