数字PCR之：染料法是什么？

数字PCR系采用终点法对PCR扩增的结果进行测量。为了检测结果的变化，这个时候需要一种额外的物质指标--荧光来对结果进行测量判读。一般来说有两种荧光检测指标：探针法和染料法。探针法是当探针结合到目标序列上以后，聚合酶降解探针后，探针上自带的荧光基团离开淬灭基团，从而发出荧光。探针法的优点是特异性好，但是其合成价格相对较高。

染料法一般使用的是Evagreen染料，这是一种可以与双链DNA小沟结合的荧光染料。Evagreen不会与单链DNA结合，且在失活状态下无荧光，只有与双链DNA结合才激活并发出荧光。因此将PCR扩增产生的双链DNA数量与荧光强度直接关联，产生终点法检测的效果。

Bruijns et al.（10.1016/j.ab.2016.07.022）曾比对了多种菁荧光团的染料荧光，发现Evagreen在低浓度的双链DNA检测中，具有极佳的检测线性。Evagreen对ssDNA结合力很低，保证了更高的信噪比。而且Evagreen对PCR反应的抑制更小，因此在实验中可以使用较高浓度，提高亮度的同时也消除了“染料重新分布”；Evagreen染料法还可以通过改变扩增产物的长度，或者调整引物的量等条件，实现多重数字PCR反应。

Evagreen染料法的实验设计及检测流程