专题 | Cell重磅文章加速外泌体生物标志物临床应用（下） / 四六文摘

基本信息

题目：Extracellular Vesicle and Particle Biomarkers Defifine Multiple Human Cancers

期刊：Cell

影响因子：38.637

客户单位：威尔·康奈尔医学院，东京大学，斯隆·凯特琳纪念癌症中心等

文章作者：Ayuko Hoshino et al.

通讯作者：Ayuko Hoshino,William R,Jarnagin,David Lyden

导读

上一期为大家解读了泛外泌体通用标志物的鉴定（点击查看上一期），本期我们将为大家解读该研究成果中关于肿瘤相关外泌体特异性通用标志物及血浆外泌体标志物确定癌症类型相关内容。

为了鉴定可用作癌症患者诊断的EVP（Extracellular Vesicle and Particle）生物标志物蛋白，该研究团队从10例胰腺癌(PaCa)和14例肺腺癌(LuCa)中分别切除肿瘤及癌旁组织进行EVP分离，通过对肿瘤及癌旁组织EVP蛋白质组进行对比，鉴定其共有和肿瘤特异性EVP蛋白。

PaCa（胰腺癌）和LuCa（肺腺癌）手术切除的组织移植物中特异性EVP蛋白分析

结果，胰腺癌(PaCa)和肺腺癌(LuCa)中，分别鉴定出356和123个EVP富集蛋白；在胰腺癌(PaCa)和肺腺癌(LuCa)高表达的600多个EVP蛋白中，鉴定了11个共有EVP蛋白。基因富集分析发现，EMT、凝血和肌动蛋白信号通路在胰腺癌（PaCa）中高度富集，而细胞周期、代谢和RNA处理途径在肺腺癌（LuCa）中显著富集。表明EVP蛋白在不同类型肿瘤之间存在异质性。

此外，由于肿瘤源外泌体与免疫系统相互作用，研究团队还分析了肿瘤源EVPs是否包裹了参与激发免疫反应的特定蛋白，如损伤相关分子模式(DAMP)蛋白，它们在癌症发展和肿瘤进展中起着关键作用。

肿瘤相关外泌体特异性通用标志物分析结果

在确定了肿瘤组织特异性EVP蛋白后，研究团队接下来对肿瘤和非肿瘤组织源EVP蛋白质组进行对比分析，来确定是否能区分癌症与非癌症。共计分析了131个组织移植物和20个骨髓来源的EVP样本，其中肿瘤组织源样本85个，非肿瘤组织源样本66个。采用随机森林分类法，鉴定出区分健康和肿瘤患者的16个EVP蛋白。

➤多种类型肿瘤手术切除组织移植物中肿瘤相关EVP特征鉴定

随机森林分类法对高预测价值蛋白在肿瘤和非肿瘤样本中进行分类

基于16个EVP蛋白，对模拟测试样品采用10倍的交叉验证产生95%的敏感性（真阳性率)和92%的特异性(真阴性率）；当应用于独立的测试样品时，基于EVP蛋白子集的模型达到90%的灵敏度和94%的特异性；而基于肿瘤移植物的EVP中检测到的所有2,240个蛋白的模型达到100%的灵敏度和88%的特异性。当然，还需要对更大的样本进行分析，以进一步验证该模型，并明确组织特异性肿瘤相关EVP特征。

➤多种类型肿瘤手术切除组织移植物中肿瘤相关EVP特征鉴定

分类误差矩阵采用75%模拟测试和25%独立测试样品的随机森林分类法对上述16种蛋白和2,240个组织移植物EVP蛋白进行分析

值得注意的是，THBS2和VCAN，在胰腺癌（PaCa）和肺腺癌（LuCa）肿瘤组织中是高度富集的EVP蛋白，在识别癌症方面具有预测作用，提示这些蛋白可作为泛癌EVP标记。此外，特定的EVP粘附标志物(如CD36，TNC，THBS2，VCAN) 和代谢酶(如ADH1B，AHCY，PGK1)可能是泛癌标志物。

癌症类型相关血浆外泌体标志物分析结果

由于血浆是最容易获得的液体活检来源，因此，为了解肿瘤相关EVP蛋白的特性和组成，研究团队首先试图确定哪些蛋白存在于胰腺癌（PaCa）和肺腺癌（LuCa）患者的血浆中。接着，研究这些蛋白是否来源于肿瘤组织、癌旁/远端组织或其他部位。

该研究共计分析了9例胰腺癌（PaCa）患者(78% II期和22%III期)和12例肺腺癌（LuCa）患者(50% I期、42% II期和8% III期)的血浆EVP蛋白质组，选择30%以上患者血浆中出现，但28例健康成人对照组血浆中从未出现的EVP蛋白，从而发现了51种和19种血浆源EVP蛋白分别是胰腺癌（PaCa）和肺腺癌（LuCa）所特有的。

➤组织和血浆源EVPs中肿瘤相关蛋白的鉴定和验证

30%以上胰腺癌患者血浆源EVP样品中出现但从未在HC血浆源EVP样品中发现的蛋白与移植物源EVPs(PaCa TT和AT）进行对比分析

➤组织和血浆源EVPs中肿瘤相关蛋白的鉴定和验证

30%以上肺腺癌患者血浆源EVP样品中出现但从未在HC血浆源EVP样品中发现的蛋白与移植物源EVPs(LuCa TT, AT, DT）进行对比分析

为了确定这些EVPs可能的来源，研究团队将这些血浆源的EVP蛋白与TT、AT和DT源的EVP蛋白质组进行了比较。有趣的是，诸如BAIAP2L1，ALPL，PTPRJ，FCER1G，TMEM2等蛋白在血浆和肿瘤源的胰腺癌（PaCa） EVP中都存在，但在16个癌旁组织源的EVP样品中表达水平极低或检测不到，表明这些蛋白最有可能来源于胰腺肿瘤细胞。

癌蛋白KRAS常在肿瘤组织源EVPs中发现（76%），在胰腺癌（PaCa）患者的血浆EVP中也被检测到。令人惊讶的是许多蛋白，如LRRC26，ABCB1，ABCB11，ADGRG6，DSC1，DSG1，KRT81及PLGLB1在肿瘤组织和癌旁组织源的EVPs中不存在或低水平存在，但特定存在于PaCa患者血浆源的EVPs中，表明这些EVP蛋白来源于远端器官或免疫细胞，它们从未在健康人对照组血浆EVPs中被发现，从而更加证实了癌症是一种系统性疾病的观点，它改变了远端器官和免疫细胞的EVP内容物。

对于肺腺癌（LuCa），研究团队鉴定了超过30%的患者中存在的19种血浆EVP蛋白。与胰腺癌（PaCa）不同，在肺腺癌（LuCa）肿瘤组织中检测到的所有蛋白也在癌旁和大部分远端组织中发现。SELENOP，RHOV，RC3H2， CLDN5，DMTN及ERN1仅在血浆中检测到，而在肿瘤组织、癌旁或远端组织中检测不到，也支持了癌症的系统性观点。例如，肝源性SELENOP，经常出现在来自肺腺癌（LuCa）患者的血浆源EVPs中，从未在肺源EVPs中检测到，表明肺腺癌（LuCa）影响肝功能。

为了证明这些发现不仅限于肺腺癌（LuCa）和胰腺癌（PaCa），或常见的成人癌症，该研究团队检测了从晚期患者中分离出的肿瘤组织和血浆源EVPs，其中两种是最常见的儿童实体瘤：神经母细胞瘤和骨肉瘤。

➤组织和血浆源EVPs中肿瘤相关蛋白的鉴定和验证

30%以上神经母细胞瘤患者血浆源EVPs中出现但从未在HC血浆源EVPs中发现的蛋白在肿瘤移植物EVPs中的分析

➤组织和血浆源EVPs中肿瘤相关蛋白的鉴定和验证

30%以上骨肉瘤患者血浆源EVPs中出现但从未在HC血浆源EVPs中发现的蛋白在肿瘤移植物EVPs中的分析

儿童肿瘤生长快速从而超过它们起源的器官，因此致使癌旁组织取样非常具有挑战性。该研究分析了9例神经母细胞瘤和7例骨肉瘤患者肿瘤来源EVPs及15例神经母细胞瘤和5例骨肉瘤患者血浆源EVPs,同时检测了来自15名儿童健康对照组血浆源EVPs。该分析集中在33%以上的癌症患者血浆中能检测到，但未在任何对照受试者血浆中检测到的EVP蛋白上。在神经母细胞瘤发现10个血浆EVP蛋白FTH1，KRT17，H3F3A，ABCB9，ADAMTS13，CD14，EPB42，HGFAC，KRT13及 KRT8与细胞增殖/细胞周期和分化相关。在骨肉瘤中，鉴定了6个血浆EVP蛋白，ACTA1, ACTG2，ADAMTS13，HGFAC, MME及TNC与组织形态发生有关。有趣的是，EVP蛋白内容物反映了每个癌症的起源细胞（成骨细胞与神经母细胞）。

为了验证胰腺癌（PaCa）血浆EVP TOP蛋白列表，研究团队根据最新数据库重新对样本进行了分析，确定了TOP EVP蛋白列表。选取了在胰腺癌（PaCa）血浆中特定表达，但28例健康对照组血浆中不表达的TOP20 EVP蛋白。接着采用质谱的方法分别对15例胰腺癌（PaCa）及15例健康对照组分离的血浆源EVPs进行TOP20 EVP蛋白的定量。80%的标志物如CA2,LTF,BAIAP2L1,KRAS,PEBP1及CD55通过该方法得到了证实。

➤组织和血浆源EVPs中肿瘤相关蛋白的鉴定和验证

在胰腺癌患者和健康对照组中采用质谱方法验证胰腺癌TOP20血浆标志物

➤组织和血浆源EVPs中肿瘤相关蛋白的鉴定和验证

上述数据的Log2蛋白表达情况

此外，3个胰腺癌（PaCa）特异性EVP蛋白CA2,LTF及CD55还通过ELISA方法进行了验证。

➤组织和血浆源EVPs中肿瘤相关蛋白的鉴定和验证

15例胰腺癌和15例健康对照组血浆EVP中CA2，LTF，CD55的ELISA验证

总之，数据表明与健康对照组相比，EVP蛋白质组学鉴定的16/20胰腺癌（PaCa）EVP蛋白在胰腺癌（PaCa）血浆EVPs中有更高水平的表达。接着研究团队基于最新数据对肺腺癌（LuCa）数据进行了重新分析，发现RHOV在肺腺癌（LuCa）EVPs中都保持较高水平。通过ELISA的方法，研究团队证实与7例健康对照组血浆EVPs相比，RHOV在14例肺腺癌（LuCa）EVPs中的表达水平显著升高。

➤组织和血浆源EVPs中肿瘤相关蛋白的鉴定和验证