pcr实验扩增的原理和步骤 / 四六文摘

PCR，又称聚合酶链式反应，基本原理类似于 DNA 的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR 由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成。

①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备；

②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在Taq酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。

重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

10×扩增缓冲液　 10 ul

4种dNTP混合物　各200 umol/L

引物　　　　　各10～100 pmol

模板DNA 　　　　0.1～2 ug

Taq DNA聚合酶　 2.5 u

Mg2+　　　　　　 1.5 mmol/L

加双或三蒸水至　 100 ul

（1）PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。

（2）模板的取材主要依据PCR的扩增对象，可以是病原体标本如病毒、细菌、真菌等。也可以是病理生理标本如细胞、血液、羊水细胞等。法医学标本有血斑、精斑、毛发等。

（3）标本处理的基本要求是除去杂质，并部分纯化标本中的核酸。多数样品需要经过SDS和蛋白酶K处理。难以破碎的细菌，可用溶菌酶加EDTA处理。所得到的粗制DNA，经酚、氯仿抽提纯化，再用乙醇沉淀后用作PCR反应模板。

1. PCR反应的缓冲液提供合适的酸碱度与某些离子。

2. 镁离子浓度总量应比dNTPs的浓度高，常用1.5 mmol/L。

3. 底物浓度dNTP以等摩尔浓度配制，20～200 umol/L。

4. TaqDNA聚合酶2.5U(100 ul）。

5. 引物浓度一般为0.1 ～0.5 umol/L。

6. 反应温度

（1）变性温度和时间95℃，30 s。

（2）退火温度和时间低于引物Tm值5 ℃左右，一般在45～55℃。

（3）延伸温度和时间72℃，1 min/kb(10 kb内）。

（4）Tm值=4(G+C) +2(A+T)

7. 循环次数：一般为25 ～30次。循环数决定PCR扩增的产量。模板初始浓度低，可增加循环数以便达到有效的扩增量。但循环数并不是可以无限增加的。一般循环数为30个左右，循环数超过30个以后，DNA聚合酶活性逐渐达到饱和，产物的量不再随循环数的增加而增加，出现了所谓的“平台期”。

pcr实验扩增的原理和步骤