pcr实验扩增的原理和步骤

PCR实验原理及步骤

PCR,又称聚合酶链式反应,基本原理类似于 DNA 的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR 由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成。

实验方法原理

①模板DNA的变性:模板DNA经加热至94℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应做准备;

②模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;

③引物的延伸:DNA模板--引物结合物在Taq酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。

重复循环变性--退火--延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2~4分钟, 2~3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

PCR反应体系

10×扩增缓冲液     10 ul

4种dNTP混合物   各200 umol/L

引物            各10~100 pmol

模板DNA      0.1~2 ug

Taq DNA聚合酶    2.5 u

Mg2+       1.5 mmol/L

加双或三蒸水至    100 ul

模板制备

(1)PCR的模板可以是DNA,也可以是RNA。

(2)模板的取材主要依据PCR的扩增对象,可以是病原体标本如病毒、细菌、真菌等。也可以是病理生理标本如细胞、血液、羊水细胞等。法医学标本有血斑、精斑、毛发等。

(3)标本处理的基本要求是除去杂质,并部分纯化标本中的核酸。多数样品需要经过SDS和蛋白酶K处理。难以破碎的细菌,可用溶菌酶加EDTA处理。所得到的粗制DNA,经酚、氯仿抽提纯化,再用乙醇沉淀后用作PCR反应模板。

PCR反应条件控制

1.  PCR反应的缓冲液提供合适的酸碱度与某些离子 。

2.  镁离子浓度总量应比dNTPs的浓度高,常用1.5 mmol/L。

3.  底物浓度dNTP以等摩尔浓度配制,20~200 umol/L。

4.  TaqDNA聚合酶2.5U(100 ul)。

5.  引物 浓度一般为0.1 ~0.5 umol/L。

6.  反应温度

(1)变性温度和时间95℃,30 s。

(2)退火温度和时间 低于引物Tm值5 ℃左右,一般在45~55℃。

(3)延伸温度和时间72℃,1 min/kb(10 kb内)。

(4)Tm值=4(G+C) +2(A+T)

7.  循环次数 :一般为25 ~30次。循环数决定PCR扩增的产量。模板初始浓度低,可增加循环数以便达到有效的 扩增量。但循环数并不是可以无限增加的。一般循环数为30个左右,循环数超过30个以后,DNA聚合酶活性逐渐达到饱和,产物的量不再随循环数的增加而增加,出现了所谓的“平台期”。

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