结核分枝杆菌检测方法这么多，哪种方法最有效？
由结核分枝杆菌（MTB）感染引起的结核病已严重危害人类健康。据估计，世界上约有四分之一的人口感染MTB，其中5%～10%的感染者在其一生中会罹患结核病。虽然人们在减轻全球结核病负担方面取得了进展，但仍未达到“结束结核病战略”的第一个里程碑。而实现这些里程碑的关键障碍之一就是耐药结核病的高流行。
此外，同为抗酸杆菌（AFB）的非结核分支杆菌（NTM）感染通常引起与结核病相似的临床症状，但其治疗策略迥异。因此，对NTM感染的鉴别诊断也是临床亟需解决的难题。
基于此，本课题组近日的一项研究通过对大量PTB诊断的临床数据分析，提出了目前临床上快速诊断PTB和NTM感染的最佳实验诊断策略，可为今后预防和控制结核病的决策提供相关依据，研究成果发表在《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》。
结核的有效控制有赖于结核病的快速准确诊断。当前，常用的结核诊断方法包括AFB涂片、培养、分子生物学方法（如，Xpert MTB/RIF[XPERT]）和免疫学方法（如，γ-干扰素[IFN-γ]释放试验[IGRA]）。
痰AFB涂片：是使用最广泛的用于诊断活动性结核（ATB）的方法，该方法简便、价廉，但其灵敏度和特异性均较低。
MTB培养：阳性是诊断ATB的金标准，但因其耗时、费力而影响其在临床的应用。
Xpert：是一种基于PCR技术的检测方法，可同时检测MTB和利福平耐药性，具有较高的灵敏度和特异性，但价格相对较贵。
结核感染T细胞斑点试验（T-SPOT.TB）：是一种基于T细胞检测的IGRA试验，可快速（通常在一天内）检测MTB特异的γ-干扰素释放水平。IGRA可用于MTB感染的诊断，但不能区分ATB和潜在结核感染（LTBI）。
有趣的是，我们先前发现T-SPOT.TB试验中的TBAg/PHA比率（ESAT-6/PHA和CFP-10/PHA中较大的一个）可用于区分ATB和LTBI，然而其在现实临床中诊断ATB的效能尚不清楚。
单一结核诊断方法不能完全解决结核病诊断问题，而多种方法联合应用则有望成为最佳结核诊断策略。事实上，当前存在多种整合上述结核检测方法的实验诊断策略。
然而，众多的检测策略也可能干扰医务工作者选择最佳的结核病诊断方法，有时还会造成“知行分离”（know-dogap）的情况，即医务工作者通常知道什么是推荐的诊断策略，但实际上使用的是不同的诊断策略。
此外，这些策略的诊断性能可能还受到样本类型（如痰与支气管肺泡灌洗液[BALF]）、AFB涂片次数和其他因素的影响。因此，有必要在现实环境中找出一种快速诊断PTB的最佳策略。
研究方法
本研究纳入2016年1月至2019年3月期间在同济医院接受PTB评估，有PTB相关症状和体征，或持续2周以上不明原因咳嗽，或胸片提示PTB可能的患者。最终，共纳入28171例疑似PTB的成人住院患者并进行回顾性分析。
其中，BALF和/或痰标本被用于AFB涂片、Xpert检测和微生物培养，而外周血单个核细胞（PBMC）则用于T-SPOT.TB试验。以分枝杆菌培养阳性作为ATB和NTM感染的参考标准，我们评估了标本类型对上述检测方法诊断效能的影响、AFB涂片次数对PTB诊断效率的影响以及上述方法单独或联合使用对PTB和NTM感染的诊断效能。
研究结果
01 临床上PTB最常见的检查方法
本研究纳入的28171例患者中，共7528例的痰标本或BALF标本培养结果可用，MTB和NTM阳性率分别为8.9%和1.2%。通过对实际操作中PTB诊断方法的选择情况进行分析，发现临床医生选择的结核检测方法是多样的，包括8866 AFB、9388 AFB/T-SPOT和许多其他检测方法组合，其中AFB和T-SPOT是最常见和第二常见的检查手段，而且接受Xpert检测的患者比例从2016年的0.8%迅速上升到2019年的17.3%。
02 痰液和BALF用于PTB诊断的一致性探讨
在临床应用中，很少对患者同时采集痰液和BALF进行PTB诊断筛查。关于痰液和BALF标本用于AFB涂片、微生物培养和Xpert诊断结果一致性的问题，研究发现，AFB涂片、微生物培养和Xpert检测时，痰液和BALF标本诊断结果表现出中等一致性。应用AFB涂片或Xpert检测BALF的阳性检出率高于痰液；而在微生物培养中，痰培养的阳性检出率比BALF培养的检出率略高，但无统计学意义。
03 AFB涂片次数对PTB诊断的影响
数据分析显示，共有7155名患者在住院一周内进行过1-8次BALF或痰液AFB涂片检查，其中1-4次AFB涂片的灵敏度分别为24.6%、33.4%、36.2%和37.3%（如表1）。一次AFB涂片能够检测出64.7%的MTB培养阳性的AFB+患者，两次AFB涂片将检出率提高到88.0%。与两次AFB涂片相比，三次AFB涂片还检测出7.4％的AFB+结核病患者，4次涂片AFB+PTB检出率为98.3%。研究表明，至少3-4次AFB涂片才能满足95%的AFB+PTB病例的检出率。
表1
04
AFB涂片、Xpert或T-SPOT单独应用在PTB诊断中的表现
结果表明，AFB涂片和Xpert检测方法均表现出大于95％的高特异性，但AFB涂片的灵敏度为19.8％，远低于Xpert的79.7％。根据AFB涂片状态，Xpert检测性能也有所不同，在AFB+/微生物培养阳性的结核病患者中Xpert识别率高达97.8％，但对于AFB-/微生物培养阳性的结核病患者，其识别率只有75.3％。（表2）
除了AFB涂片和Xpert外，本研究还应用T-SPOT中两种不同的判读方法来诊断PTB病例，一种方法是使用制造商定义的临界值（T-SPOTMDC），另一种是使用MTB特异性抗原与植物血凝素斑点形成细胞的比率（TBAg/PHA）。结果发现，尽管T-SPOTMDC和Xpert表现出相似的敏感性，但特异度却比Xpert低得多。当使用TBAg/PHA比值时，其特异度显着提高，但灵敏度却降低。（表2）
表2
05
AFB涂片和Xpert联合可有效鉴别PTB和NTM感染者
与单独使用Xpert相比，AFB涂片和Xpert的联合检测并没有进一步提高其诊断PTB的灵敏度和特异度，但能够更有效地区分PTB和NTM感染病例，AFB和Xpert的联合使用可以检测出80.2％通过微生物培养证实的PTB患者，以及28.6%的NTM感染者。（表3）
表3
06
T-SPOT与AFB涂片或Xpert结合诊断PTB
研究发现T-SPOTMDC与AFB联合应用的灵敏度和特异度与T-SPOTMDC单独应用的灵敏度和特异度相当，并不能改善PTB的诊断性能。而T-SPOTMDC与Xpert联合使用时，其灵敏度和阴性预测值（NPV）分别增加到95.0%和99.1%，远远高于Xpert或T-SPOTMDC单独使用。（表2）
可以看出，尽管T-SPOTMDC与Xpert联合或与AFB/Xpert联合使用可大大提高其灵敏度，但其代价是特异度的降低。而当TBAg/PHA≥0.3时，T-SPOT与AFB涂片或Xpert结合使用时，特异性显着提高。
07
T-SPOT在不同的AFB涂片和Xpert结果状态下诊断肺结核的效能
将患者分为AFB-/Xpert-、AFB+/Xpert+、AFB+/Xpert-、和AFB-/的Xpert+四个组，结果发现，对于AFB-/Xpert-患者，T-SPOTMDC表现出高NPV（99.1%）、次优敏感性（74.4%）和特异性（71.0%）。当使用TBAg/PHA≥0.3时，特异度显着提高至95.7％，但灵敏度降低至16.3％。（表4）
表4
研究结论
研究表明：①3-4次AFB涂片比1-2次AFB涂片具有更高的灵敏度；②AFB涂片和Xpert检测中BALF标本优于痰液标本；③与AFB涂片相比，Xpert的敏感性更高，并且Xpert和AFB涂片联合用于诊断MTB和NTM感染的准确性显着提高；④T-SPOTMDC和TBAg/PHA比值对AFB-/Xpert-患者的PTB诊断有辅助作用。
基于上述结论，我们提出了可能是目前PTB最佳的临床快速诊断策略：AFB涂片（3-4次涂片）和Xpert应首先在痰液或BALF标本中进行，以便在高流行地区快速诊断ATB和NTM感染（图1）；BALF标本是AFB涂片和Xpert的首选；此外，T-SPOTMDC和TBAg/PHA比值可分别用于AFB-/Xpert-的PTB病例的排除和纳入性诊断。尽管如此，Xpert所检测到的RIF耐药需表型耐药试验进行确证，因为基因型耐药并不完全等同于表型耐药。
图1
本研究通过对大量真实临床数据集的分析，确定了目前快速诊断PTB的最优策略，可用于高流行地区PTB和NTM感染的快速诊断，也将为决策者在制定地方和国家级结核预防和控制措施时提供相关的决策依据。
孙自镛教授
孙自镛教授，博士研究生导师。1986年毕业于同济医科大学，获医学学士学位。此后获得医学硕士学位、内科学（传染病学）博士学位。现任华中科技大学同济医学院附属同济医院检验科主任、国家卫健委临床检验标准专业委员会委员、中国医院协会临床检验专委会常委、中华医学会检验医学分会委员、中华医学会细菌感染和耐药防治分会委员、中华预防医学会医院感染控制分会委员、全国细菌耐药性监测网专家委员会委员、中国合格评定国家认可委员会医学实验室认可主任评审员、湖北省细菌耐药监测网/真菌病监测网负责人。主要从事感染性疾病实验诊断和控制领域的临床、科研、教学工作。
彭静博士
彭静，副主任技师，华中科技大学免疫学博士，肝病基础医学与实验诊断协作组成员，中国麻风防治协会皮肤性病检验与诊断分会委员，中国医药质量管理协会医学检验质量管理专业委员会全国委员，中国医疗器械行业协会现场快速检测（POCT）分会委员。2011-2012年赴德国杜伊斯堡-艾森大学医院病毒研究所访问学习。现就职于同济医院检验科分子诊断组，从事感染性疾病的实验诊断工作，并承担临床和技术咨询工作。长期致力于临床一线检验、教学和科研工作，熟悉病原微生物的免疫和分子诊断技术及其质量控制，对嗜肝病毒的致病机制、少见检测结果模式的临床意义以及诊断方法的优化等方面有较为深入的研究。对引起免疫功能低下人群的病原体感染的诊断有一定的研究。在Clinical Infectious Diseases等感染病权威杂志上发表多篇SCI论文。
参考文献：
PengJing, Song Juan, Wang Feng, et al. Harnessing Big Data to Optimize anAlgorithm for Rapid Diagnosis of Pulmonary Tuberculosis in aReal-World Setting. Front. Cell. Infect. Microbiol., 18 March2021.
https://doi.org/10.3389/fcimb.2021.650163.