二代测序 之 杂交捕获
写在前面:
本次更新主要介绍文库构建完成后对目标文库的富集方法——“杂交捕获法”,这一期小编将重点介绍杂交捕获法的实验流程及其作用。
1.为什么进行杂交捕获?
在文库构建完成后,若是做全基因组测序(Whole Genome Sequencing,WGS),可直接将构建好的文库按照一定的浓度、测序深度、数据量进行上机测序即可。但在实际的操作中,由于人的基因组中存在大量丰富的重复DNA序列,且考虑到测序成本的问题,所以通常会进行靶向测序,即选择我们需要的区域进行测序,比如全外显子测序(Whole-exome sequencing,WES),或者针对肿瘤患者设计的特定的Panel测序等(一个Panel指包含所有探针的一个集合,eg:一个Panel里包含200个探针,200个探针的集合就是一个Panel)。那么如何获得所需的目标区域或者靶序列呢?就需要探针与靶序列进行杂交,然后再通过捕获杂交片段的方法进行目标区域的富集。
2. 实验流程&作用
2.1 杂交准备
杂交需要投入的原料:
①一定量的文库:可以是一个文库或者多个文库,多个文库的话可根据不同的接头序列区分每个样本;
②Human Cot DNA:封闭大量重复的DNA序列,避免非特异性杂交;
③Universal Blockers:封闭接头序列,避免非特异性杂交;
④不同的Panel:生物素标记的探针,主要负责与靶序列杂交;
⑤杂交Buffer、杂交Enhancer、NF水等(图中未展示);
注:杂交原料进行杂交时,由于杂交体积限制,都会进行体积浓缩,常用到的是采用真空浓缩的方法;此外还有磁珠法浓缩;针对不同的浓缩方法,各种杂交原料的加入顺序有一定的差异。
真空浓缩法:①+②+③→真空浓缩→+④+⑤→杂交。
磁珠浓缩法:①+②+④→磁珠浓缩→+③+⑤→杂交。
真空浓缩法在小Panel杂交的过程中表现比磁珠浓缩法较好,但磁珠浓缩法更简便快捷,成本更低。
2.2 杂交
95℃将文库变性为单链状态;
65℃进行杂交;
注:A&C:表示探针与靶序列杂交;B&D表示未杂交。
2.3 捕获
通过链霉亲和素磁珠与生物素标记的探针特异性结合,再利用磁珠和磁铁之间的相互作用“抓”出靶标片段。
2.4 洗脱
该步骤主要是洗掉一些非特异性杂交的片段(65℃热热洗脱),以及未杂交的片段、多余探针、杂交Buffer、杂交Enhancer 等杂质,只保留与探针杂交的靶序列。
2.5 PCR扩增&纯化
通过PCR扩增对靶片段进行富集,PCR循环数根据Panel的大小而定(一般Panel较大扩增循环数较少,相反则较多)。
2.6 文库质检
①文库浓度:常用的是Qubit法对杂交文库浓度进行测定。
②文库质量:常用的是Agilent 2100测定杂交文库的片段大小范围。
文库质检与上机测序密切相关。
待续
小编后续会介绍杂交捕获过程中非特异性杂交的情况,同时会继续从每个步骤详细介绍NGS的流程。
今天来个小插曲→ 实验室的故事1
下面是一段来自实验室的对话:
A:一边做着实验一边对B说,我等会儿要做到恒温孵育了,帮我开一下孵育箱;
B:好的;
过了一会儿
A:走到孵育箱前一直笑
,发现孵育箱的“门”确实是B帮忙打开了
。