CRISPR/Cas9技术在RKO细胞中的应用

CRISPR/Cas9系统正在改变许多生物医学研究前景，包括癌症研究。通过灵活的可编程性和诱导DNA双链断裂，实现了在体外或体内将癌症突变引入细胞。然而，并非所有突变对肿瘤的发生都有同样的作用，区分肿瘤生长和存活的基本突变和生物惰性突变是很麻烦的。Sayed等人提出了一种在RKO细胞中筛选高通量突变的功能相关性的方法。他们利用CRISPR/Cas9系统探测结直肠癌细胞系中的癌症脆弱性, 使用正筛或负筛从整个集合群体中分离具有特定表型变化的细胞，来尝试识别新的癌症驱动突变。他们设计了100个高质量的sgRNAs，这些sgRNAs能够特异性切割RKO细胞中存在的突变。然后生成一个包含这些sgRNAs的多功能慢病毒文库，并用于联合筛选，以探测这些突变可能的生长条件。收集不同时间点的基因组DNA，PCR扩增、纯化sgRNA，并通过深度测序定量sgRNA计数。分析结果显示，在RKO细胞中，两个靶向相同突变的sgRNAs(UTP14A：S99delS)将随着时间的推移而耗尽（图1A）。实验结果证实，该突变的失活损害了细胞生长，因此Sayed等人认为UTP14A：S99delS是RKO细胞中的驱动突变(图1B)。上述的研究结果表明利用CRISPR/Cas9系统能实现在功能上大规模分离癌症突变，这显然对未来癌症的研究和治疗提供了有效的帮助^[2]。