MET靶向药已经在中国获批，如何辨别检测报告中的MET 14号外显子跳跃突变？
*仅供医学专业人士阅读参考
MET TKI在国内外相继获批治疗MET 14外显子跳跃突变的晚期NSCLC，MET 14号外显子跳跃突变进入精准治疗时代。但是报告怎么看，却让人很头大！医生们临床上看到的检测报告可能是这样的：
图1 基因检测报告展示
到底以上哪个报告是MET 14号外显子跳跃突变呢？本文教你一文读懂MET检测报告！
别急，看检测报告前，先了解下面信息做足准备。
报告的突变型怎理解？
开头提到的MET变异类型，如c. 3028 3 A>T, p.S531C，医生们经常会有疑问，这些要怎么理解。其实，上面的这些变异都是根据HGVS（human genome variation society，人类基因组变异协会）标准命名规则表示的。一般包括参考信息来源[如“c.”代表编码DNA参考序列，“p.”代表蛋白（氨基酸）参考序列]，位置编号（一般根据参考序列信息，如c. 3028就是编码序列的第3028个核苷酸）以及具体发生的改变（DNA 层面就是核苷酸的变化，包括>点突变、ins插入、del删失等；蛋白层面的改变，氨基酸的变化）。
一般DNA变异命名参考都是编码DNA序列，但是一些变异可会发生在非编码区，如本文介绍的MET 14号外显子跳跃突变。对于这些变异位点，没有对应的位置编号，需要用附近编码区的位置编号作为定位参考，上游使用“-”，下游使用“ ”来进行表示。
现在再看看开始提到的几个变异型。
c. 3028 3 A>T，在第3028号编码核苷酸下游第三个非编码的核苷酸发生了点突变，从A变成T。p.S531C，蛋白第531号氨基酸从S（丝氨酸）变成了C（半胱氨酸）。
注：突变会因生信分析时参考转录本不同而比对出不同的结果，会导致位置编号不同。如参考MET基因NM_000245.3转录本，突变为c. 3028 3 A>T；但如果参考MET NM_001127500.3转录本，同一突变则表示为c. 3082 3 A>T。下列介绍均基于NM_000245.3转录本信息。
什么是MET 14号外显子跳跃突变？
MET 14号外显子跳跃突变是指MET mRNA中14号外显子丢失的现象，通常由RNA剪接异常造成。那什么又是RNA剪接？
DNA是由非编码的内含子区域和编码的外显子区域交错组成。在由DNA转录到mRNA再翻译为蛋白的过程中，需要将内含子剪切除去，并将外显子有序链接形成一个连续的RNA（mRNA）分子。这就是RNA剪接过程（如图）。
图2 RNA剪接过程
RNA剪接过程需要识别内含子上的多个区域。这些区域如果遭受到破坏或受影响，都可能导致RNA剪切异常。MET 14号外显子周围内含子的剪切相关区域发生突变时，导致外显子14被错误剪切而丢失，即所谓“MET 14号外显子跳跃突变”。
图3 MET 14外显子跳跃
MET 14号外显子跳跃突变会导致其编码的蛋白近膜结构域（JM）缺失。该结构中的Y1003残基是E3泛素连接酶CBL的结合位点，CBL结合Y1003残基将介导MET泛素化，导致MET蛋白降解，是MET蛋白主要的负调控机制。当该区域缺失时，会导致MET受体泛素化降低，MET蛋白降解降低，最终导致下游信号通路的持续激活，从而导致肿瘤发生（如图）。
图4 MET ex14 RNA正常剪接的生物学结果（左）和异常剪切的生物学结果（右）[1]
导致MET 外显子跳跃的突变区域有哪些？
上文提到发生在内含子区域的突变可能会导致外显子跳跃，那MET 14号外显子跳跃突变的区域有哪些？下图详细介绍了MET 14号外显子跳跃突变的区域，主要包括14号内含子的5'端剪接供体位点（splice donor, SD site）和13号内含子3'剪接受体位点（splice acceptor, SA site）、分支位点（Branch site, BS）和多嘧啶位点（Poly-pyrimidine tract，PPT）等。
图5 发生MET 14号外显子跳跃突变的位置[2]
据累及的功能位点的差异可以分为两大类：
一类是基因变异累及边缘经典剪接区，即位于内含子边缘SA和SD区域，如图5A所示。经典剪接区上发生的点突变或插入缺失（indel）可导致剪切子无法识别剪接受体或供体位点，从而导致MET外显子14的异常剪切。
SA site边缘1-2bp位置发生的点突变有c.2888-1，c.2888-2可直接判定为MET 14号外显子跳跃突变，例如c.2888-1G>A等。除点突变外，累及该区域的插入/缺失也可导致MET 14号外显子跳跃突变，例如c.2888-7_c.2920del。发生在该区域的突变类型以插入缺失较为多见。
SD site边缘1-2bp位置发生的点突变有c.3028 1，c.3028 2可直接判定为MET 14号外显子跳跃突变，例如c.3028 1G>A，c.3028 1G>T，c.3028 2T>A等。除经典剪接序列外，供体位点c.3028的碱基替换（例如：c.3028G>A，对应氨基酸改变为p.D1010N；c.3028G>C对应氨基酸改变为p.D1010H等），c.3028 3的碱基替换也曾被报道为MET 14号外显子跳跃突变[2][3]。同样累及该区域的插入/缺失也可导致MET 14号外显子跳跃突变，例如c.3018_ c.3028 8del。发生在该区域的突变类型以点突变较为多见。
另一类是基因变异累及内含子上的BS和PPT区域，多为发生在紧邻剪接受体位点上游约25bp的内含子非编码区的碱基替换和插入缺失突变，如上图5A所示。此类变异可能会导致RNA无法完成正常的剪接过程，故而通常会被认可导致MET 14号外显子跳跃突变。这类MET 14号外显子跳跃突变的判定主要来自文献报道[4]。
BS位点上的A碱基与RNA剪接过程中的亲核攻击有关，其核苷酸位置在如图5A所示的c.2888-29（即内含子-29位点）。若缺失的部分包含该区域，则可能导致MET 14号外显子跳跃突变。
PPT位点是RNA剪接过程中剪接因子相关蛋白与分支位点结合蛋白（SF1）相互作用的区域。其核苷酸位置在如图5A所示的c.2888-24_2888-9（即内含子-24_-9区域）。若缺失的部分涉及该区域，也可能导致MET 14号外显子跳跃突变。
此外，外显子14上发生的Y1003突变和部分缺失突变，不会干扰正常的剪接机制，即不会导致外显子14的错误剪切，但因为最终也可以导致MET降解减少、下游信号的持续激活，此时也会被报告为MET 14号外显子跳跃突变。
NGS测序过程中实际检出的变异往往会跨越多个区域影响RNA剪接，如c.2888-35_2888-17del，这个变异导致内含子-35_-17的区域发生了缺失，影响了BS以及部分PPT区域。c.2888-35_2888del这个变异不仅影响了BS位点、PPT区，还影响了剪接受体位点。这些突变都可能导致MET 14号外显子跳跃突变。
图6 剪接发生的基因组变异位置[4]
图注：研究者在1141例肺癌患者中确定了28名非鳞状NSCLC患者发生了MET突变。根据以上对于变异类型的分类，可将患者的MET突变分为图中显示的4类，其中有些患者的变异涉及多个区域。
不同类型的MET 14号外显子跳跃突变的发生率如何？
2020年ASCO口头汇报的一项针对MET 14号外显子跳跃突变肺癌患者的研究中，作者通过对60495名非小细胞肺癌患者的样本进行NGS杂交捕获测序，在1387个样本中检测出MET 14号外显子跳跃突变，包括>500种变异形式，这些突变根据累及的功能位点可分为：剪接供体位点（42%）、剪接受体位点（4.7%）、多嘧啶位点（15%）、剪接受体和多嘧啶位点（13%）、D1010（23%）、Y1003（2.1%）和全外显子缺失（0.3%）。
图7 非小细胞肺癌样本中的MET 14号外显子跳跃突变事件分布[5]
怎么针对报告进行MET 14号外显子跳跃突变的报告解读?
第一步：看数字。突变是否发生在外显子14边缘，即c.2888，-1/-2和c.3028， 1/ 2/ 3附近。如果看到c.2942和c. 3082也别先否定，确认转录本信息, 若为NM_001127500.3，也为外显子14前后。
第二步：看变异。剪接位点边缘的点突变或缺失是否影响剪切（主要看c.）。
第三步：看范围。若变异中不包括2888/3028等数字，需判断发生变异区域是否包含SA、SD、BS、PPT等功能区域。如BS，c. 2888-29， PPT c. 2888-24_c. 2888-9，以及SA、SD区域。
比如，c.2888-35_2888-17del这个变异, 影响了BS区域（c.2888-29）以及部分的PPT区域（c.2888-24_c.2888-17），推测为MET 14号外显子跳跃突变。
再比如，c.3020-c.3038 24del, 缺失范围包括了SD区域，c.3028以及c.3028 1_c.3028 3，也推测为MET 14号外显子跳跃突变。
第四步：如果是外显子14上的点突变或缺失，不能轻易下结论。
注：可导致MET 14号外显子跳跃突变的突变位置多样化且变异类型多样化，目前已报道超过500种变异可导致MET 14号外显子跳跃突变，并且仍有新的位点被报道。如检测到的突变未查询到相关文献报道，或未累及上述经典区域，判断是否发生MET 14号外显子跳跃突变，最终需要通过其他检测方法来验证，通常认为RNA水平的检测是比较好的验证方法，例如RNA NGS和实时聚合酶链反应（qRT-PCR）等。
回到一开始的检测报告，现在你能知道哪个才是MET 14号外显子跳跃突变了吗？
应建明 教授
国家癌症中心/中国医学科学院肿瘤医院病理科主任，主任医师，教授，博士生导师
中国抗癌协会肿瘤病理专业委员会候任主任委员
中国抗癌协会肿瘤病理专业委员会分子协作组组长
中华医学会病理学分会分子病理学组副组长
中国医师协会病理医师分会分子病理委员会副主任委员
中国研究型医院学会超微及分子病理专委会副主任委员
中国研究型医院学会病理学专委会副主任委员
国家肿瘤质控中心单病种质控专家委员会委员
国家抗肿瘤药物临床应用监测专家委员会委员
国家药品监督管理局医疗器械技术评审专家咨询委员会委员
中国合格评定国家认可委员会CNAS认可评审专家、评定专家
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正确答案：
1、ABCD
2、A
参考文献：
[1] [PMID: 27009743] Drilon, Alexander. “MET Exon 14 Alterations in Lung Cancer: Exon Skipping Extends Half-Life.” Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research vol. 22,12 (2016): 2832-4. doi:10.1158/1078-0432.CCR-16-0229.
[2] [PMID: 34295201] Fujino, Toshio et al. “Lung Cancer with MET exon 14 Skipping Mutation: Genetic Feature, Current Treatments, and Future Challenges.” Lung Cancer (Auckland, N.Z.) vol. 12 35-50. 20 May. 2021, doi:10.2147/LCTT.S269307.
[3] [ PMID: 25971938] Frampton, Garrett M et al. “Activation of MET via diverse exon 14 splicing alterations occurs in multiple tumor types and confers clinical sensitivity to MET inhibitors.” Cancer discovery vol. 5,8 (2015): 850-9. doi:10.1158/2159-8290.CD-15-0285.
[4] [PMID: 26729443] Awad, Mark M et al. “MET Exon 14 Mutations in Non-Small-Cell Lung Cancer Are Associated With Advanced Age and Stage-Dependent MET Genomic Amplification and c-Met Overexpression.” Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology vol. 34,7 (2016): 721-30. doi:10.1200/JCO.2015.63.4600.
[5] Awad, M. et al. “Characterization of 1,387 NSCLCs with MET exon 14 （METex14） skipping alterations （SA） and potential acquired resistance （AR） mechanisms.” Journal of Clinical Oncology 38 （2020）: 9511-9511.