净水技术|水厂砂滤池内氨氧化菌对氨氮去除的效能
小编导读
介绍在常规工艺条件下饮用水氨氮去除难题，利用分子生物学技术对饮用水处理工艺中滤池内不同滤料样品的微生物量和氨氧化菌进行了初步探索。发现氨氧化细菌在滤池硝化去除氨氮中起主导作用；DS水厂砂滤池滤料表面氨氧化细菌占细菌总数的比例最大；各滤池内氨氧化古菌占滤料表面古菌的比例均较低，这为生物硝化作用去除饮用水中氨氮提供了理论依据。
长期以来，研究者普遍认为化能自养型的氨氧化细菌( ammonia-oxidizing bacteria，AOB)是生物地球化学氮循环过程中最主要的承担者。随着近年来环境微生物分子生态学技术的发展和研究的深入，研究者发现另一类具有氨氧化能力的微生物——氨氧化古菌( ammonia-oxidizing archaea，AOA)。AOA是一类以重碳酸盐为碳源、利用铵态氮氧化产生细胞能量进行化能无机自养生长的独立于氨氮氧化细菌（ammonia-oxidizing bacteria，AOB）进化分枝外的进化类群，属于泉古菌门( Crenarchaeota )。AOA广泛分布于海洋和土壤等各种类型的生态系统中，在地球生态系统的氮素循环过程中可能起着相当重要的作用。国内外迄今为止主要关注自然界氮循环过程中AOA和AOB两类不同菌群对氮的生物转化，而对饮用水净化单元微生物硝化过程与机制的研究较少。
试验以长时间挂膜运行的中试滤柱、砂滤池和颗粒活性炭等不同体系为基础，从中进行采样和分子水平的微生物种群分析，以期在分子水平上更为深入地认识微生物硝化去除氨氮的机制。
分别采集MK水厂砂滤池、DS水厂砂滤池、活性炭池以及填料滤池滤料进行分子级试验分析。其中，分别选取DS水厂砂滤池距离表面3、50 cm的滤料，活性炭池和填料滤池的滤料为上层滤料，距离表面3 cm。取得的滤料置于-80 ℃下保存。分别标注：1为活性炭3个平行样；2为MK砂滤池上层砂3个平行样；3为填料滤池上层3个平行样；4为DS水厂砂滤池3 cm 3个平行样；5为DS水厂砂滤池50 cm 3个平行样。
将冷藏的滤料从-80 ℃冰箱中取出置于室温下一段时间后提取DNA，采用PowersoilTM DNA Isolation Kit（线粒体DNA提取试剂盒）（2746 Loker Ave West，Carlsbad CA 92010），具体方法参照厂家说明书。DNA置于-20 ℃冷冻保存备用。
（1）先取TAE（三-乙酸）母液，（稀释50倍）到TAE瓶中，如取20 mL 稀释到1 L；
（2）用AGAROSE（琼脂糖）0.8 g/100 mL，称量后，用TAE稀释液溶解；
（3）打开电泳仪，槽内倒入使用的TAE；
（4）将（2）中溶液放入微波炉中，高温溶解约1 min，取出后打开盖子，等温度降至不烫手后加入
染色剂（溴化乙锭）10 μL/100 mL，混匀；
（5）倒入到含有梳子的胶槽中，避光凝固30 min，小心拔出梳子，留出加样孔；
（6）将胶槽放进电泳仪中；
（7）在加样孔中加入样品（样品＋上样缓冲液，其中样品体积1~3 μL，缓冲液体积<1μL），第一个槽子中加入标准分子量样品（DNA Marker III分子量不同的DNA片段），其它的每个样品加一个加样孔。图像显示一般DNA分子量大的跑得慢。
利用Real-time PCR对滤料中的细菌16S rRNA基因、古细菌16S rRNA基因、氨氧化细菌的amoA基因和氨氧化古菌的amoA基因进行定量分析，所用引物如表1所示。所有反应中添加牛血清蛋白（BSA）和2 μL的DNA模板。
表1 Real-Time PCR的引物和温度程序
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目标微生物 |
目标基因 |
引物序列 |
温度程序 |
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细菌 |
16S rRNA |
341F: CCTACGGGAGGCAGCAG 518R: ATTACCGCGGCTGCTGG |
30 s at 95 °C, 40 cycles of 5 s at 95 °C, 31 s at 60 °C |
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古菌 |
16S rRNA |
Parch519F: CAGCMGCCGCGGTAA Arch915R:GTGCTCCCCCGCCAATTCCT |
30 s at 95 °C, 40 cycles of 5 s at 95 °C, 30 s at 50 °C, and 40 s at 72 °C |
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AOB |
amoA |
amoA-F: GGGGTTTCTACTGGTGGT amoA-R:CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC |
30 s at 95 °C, followed by 40 cycles of 5 s at 95 °C, 30 s at 55 °C, and 45 s at 72 °C |
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AOA |
amoA |
amoAF: STAATGGTCTGGCTTAGACG amoAR: GCGGCCATCCATCTGTATGT |
30 s at 95 °C, followed by 40 cycles of 5 s at 95 °C, 1 min at 53 °C, and 1 min at 72 °C |
用质粒提取试剂盒提取含有目标基因的质粒，质粒DNA纯度和浓度用Nanodrop eppordorf管（品牌为Nanodropr的eppordorf管）（型号为：Eppendorf Biophotometer Plus）测定。质粒的分子量用MBAdvanced DNA Analysis软件计算，然后换算到标准质粒DNA溶液的基因拷贝数。
以质粒为标准曲线模板进行Real-time PCR分析。Real-time PCR反应在ABI 7300 Real-Time PCR仪上进行，按照AppliedBiosystems公司的仪器使用说明书要求进行实验操作。首先，列组份配制PCR反应液，如表2所示，需要注意的是反应液配制需在冰上进行，之后进行Real-time PCR 反应。
表2 PCR反应液的配制
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试剂 |
使用量/μL |
终浓度 |
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SYBRRPremix Ex TaqTM (2x) |
10.0 |
1× |
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PCR Forward Primer (10 μmol) |
0.4 |
0.2 μmol*1 |
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PCR Reverse Primer (10 μM) |
0.4 |
0.2 μmol*1 |
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ROX Reference Dye (50x) or ROX Reference DyeⅡ (50x)*3 |
0.4 |
1× |
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DNA 模板 |
2.0 |
*2 |
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dH2O(灭菌蒸馏水) |
6.8 |
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Total |
20.0 |
*4 |
（注：1×代表不用稀释的溶液；*2、*4为SYBR Premix Ex TaqTMII （产品说明书 Real Time PCR）中备注2和备注4，详见说明书。备注2：ROX Reference Dye Ⅱ(50×)比ROX Reference Dye(50×)浓度低，使用ABI 7500/7500 Fast Real-Time PCR System时，请使用ROXReference Dye Ⅱ(50×)。使用ABI 7300和StepOnePlusTM Real-Time PCR System时，请使用ROX Reference Dye（50×）；备注4：按照各仪器推荐体系进行反应液配制）
细菌16S rRNA基因的反应程序按照两步法进行。第一步：预变性95 ℃预变性30 s。第二步：PCR 95 ℃反应5s，60 ℃延伸31 s，此时采集荧光信号，40个循环。第三步：接溶解程序，95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min，95 ℃ 15s，60℃ 1 min。
古细菌16S rRNA基因、amoA基因和Arch-amoA基因的反应程则采用三步法：95 ℃ 30 s； 40个循环的95 ℃ 15 s，退火复性，72 ℃延伸（具体的温度程序如表1所示，并于80~83 ℃ 26 s收集荧光信号，以减少引物二聚体的干扰。反应完成后设置溶解曲线用以检验产物的特异性，其程序为60~95 ℃时，每0.5 ℃读数，其间停留15 s。表征Real Time-PCR标准曲线的相关系数R2均大于0.99，溶解曲线分析发现Tm值比较稳定。
各试验样品中DNA提取的凝胶电泳结果如图1所示，对比不同样品各个滤池上层砂子中的DNA情况，活性炭滤池、DS砂滤池中的滤料DNA反应出来的亮度较高，说明活性炭池和DS水厂砂滤池中DNA含量较高，而MK砂滤池和填料滤池上层滤料中的DNA相对含量较低。
图1 DNA提取的凝胶电泳图
（注：1-活性炭3个平行样；2-MK砂滤池上层砂3个平行样；3-填料滤池上层3个平行样；4-DS砂滤池3 cm 3个平行样；5-DS砂滤池50cm 3个平行样）
具体地看每个滤池中不同平行样之间略有差别，一方面说明在微生物在滤池内部的分布是不均匀的，即便在同一层同一处上不同的滤料表面微生物的含量和种类都有可能不同。其中由DNA凝胶电泳图反映出来DS水厂砂滤池滤料中DNA浓度最高，DS水厂砂滤池中采用无烟煤和石英砂混合滤料，其中无烟煤厚度约为30 cm，石英砂厚度为1 m，长期运行后在距离表层约50 cm处是掺杂有无烟煤和石英砂的滤料，该层滤料相对较复杂可能更有利于多种微生物的附着生长。相比之下具有较高表面积的活性炭滤池滤料中的DNA浓度相对DS水厂砂滤池中滤料较低，这一方面是因为工艺段上碳滤池是在砂滤池之后，砂滤池进水的有机物浓度相比碳滤池较高利于微生物的生长；一方面可能是由于该活性炭池运行时间仅一年，适合各温度条件下的微生物生长尚未完善，故所涉及到的DNA量相对较低；另一方面是因为在该活性炭池之间有臭氧工艺，在臭氧氧化中水中的部分微生物被杀灭，不利于在后续活性炭上的滋生，而且在实际臭氧工艺运行过程中都会留有部分的剩余臭氧以保证臭氧量，多余的臭氧在处理时可能会有剩余进而进入活性炭池对活性炭上的微生物有一定的影响。
DNA浓度的测定采用凝胶电脉法测定，将冷藏的滤料提取完DNA后，在eppordorf管测定DNA浓度，再根据提取DNA体积（如100 μL）换算为ng/g。具体方法及步骤见1.2和1.3。
为了更具体地说明不同滤池中滤料的生物量情况，我们测定了各滤料中DNA浓度，定量地分析各滤池中微生物量的区别，如图2所示。
由图2可知，DS砂滤池的滤料中DNA浓度值最高，其中在距离表面3 cm处的DNA浓度可以达到2 247ng/g滤料，在距离表面50 cm处DNA浓度低于3 cm处的，说明在随着滤料在滤池中深度的增加DNA浓度会降低，从而验证了在滤池不同滤层上氨氮的去除率是不同的，并且上层去除率高于下层的氨氮去除率。对于不同滤池而言，所取的活性炭池滤料为表面3 cm处的，其DNA浓度低于相同位置的DS砂滤池滤料，但和DS砂滤池50 cm处滤料中的DNA浓度较接近，由于取样条件限制，未能取得活性炭不同滤层中的滤料，因此无法说明活性炭池生物量随滤池深度的变化情况。
其中，DNA浓度中区别最大的就是MK砂滤池和填料滤池上方的滤料，试验时填料滤池和MK砂滤池的进水情况一致，且均采用较细的石英砂（粒径为0.5~1.2 mm），但填料滤池中的石英砂为全新砂子，至取滤料时使用时间仅一年半。但仍可以看出填料滤池滤料中DNA浓度略高于MK砂滤池中石英砂，使用时间相对较短的填料滤池中石英砂中生物量比使用时间较长的MK砂滤池多，一方面说明相同滤池条件下，悬挂生物填料能够促进滤池中生物量的增加。之前研究显示，填料滤池的氨氮去除率相对空白砂滤池即普通砂滤池较高，从而进一步佐证通过悬挂生物填料方法强化滤池去除饮用水中氨氮具有一定的意义，并且可行性较大，但是由于滤池本身需要反冲洗以及反冲洗对微生物的影响等多种因素，因此，应该继续研究反冲洗等对氨氮去除和微生物量的影响，从而优化出利于饮用水处理工艺中微生物生长活动的运行参数。
由于DNA浓度给出的仅是微生物总量，而非硝化菌群，因此继续对滤池中DNA的进行较深入研究，分析其中具有氨氮能力的菌的含量。
滤池中氨氮的去除一部分是靠滤料表面的吸附而去除，但其最终是要靠微生物作用彻底去除。我们测定了DS水厂砂滤池和碳滤池中氨氮去除率，以便分析DS水厂砂滤池和炭滤池对不同浓度氨氮的去除效果，如图3所示。
由图3可知，DS水厂2012年砂滤池和碳滤池的氨氮去除率，DS水厂碳滤池是于2012年1月正式运行，在运行的初始几个月内氨氮去除氯较低约20%，低于砂滤池，随着运行时间的延长，与砂滤池的差距减小。在水源污染期7月份起，碳滤池对氨氮的去除率迅速升高，甚至超过砂滤池；随后碳滤池的氨氮去除效果有所下降，并再次低于砂滤池；11月份是水源水的第二次污染期，碳滤池氨氮去除率再次升高。由此可以推断正常时期砂滤池中的氨氮去除效果较好，而在污染期时氨氮浓度偏高时碳滤池的去除率高，并且碳滤池的高去除率维持时间较短，因此暂且可以判断碳滤池对相对较高浓度氨氮有较好的去除效果，而低浓度下砂滤池的去除效果相对较好，这和与滤池中的微生物有着密切联系。
本微生物试验分析的样品采集时间是在4月份，该时期氨氮浓度正常，属于正常期，砂滤池对氨氮的去除率由图3中可以看出高于碳滤池，与滤池中DNA浓度的情况一致。如图2中所展现的DS砂滤池中DNA浓度高于碳滤池，说明该时期砂滤池中微生物量高于碳滤池，对氨氮的生物去除能力可能会较高。
对于砂滤池来说，MK砂滤池中DNA浓度比DS砂滤池DNA浓度低得多，原因可能有很多。一方面是因为两个滤池中滤料不同，前者是单一的石英砂滤料，而后者采用了无烟煤和石英砂的混合滤料；一方面是因为两滤池反冲洗条件有所不同。
采用Real-time PCR方法研究各滤池内滤料的微生物中群落中的细菌16S rRNA基因的拷贝数以及相应比例，具体数据如表3所示。
表3各滤池内细菌和古菌的基因拷贝数以及相应的比例
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样品 |
基因拷贝数mg/g滤料 |
比率 |
|||||||
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细菌 16S rRNA |
古菌 16S rRNA |
amoA |
Arch-amoA |
细菌16SrRNA/古菌16S rRNA |
amoA/Arch-amoA |
amoA/细菌16S rRNA |
Arch-amoA/古菌16S rRNA |
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活性炭池 |
3.21×109 |
6.09×108 |
2.53×108 |
2.79×107 |
5.276 |
9.071 |
0.079 |
0.046 |
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MK砂滤池 |
5.47×107 |
3.42×107 |
5.38×106 |
3.16×105 |
1.601 |
17.056 |
0.098 |
0.009 |
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填料滤池上层 |
2.78×107 |
1.51×107 |
3.98×106 |
7.39×105 |
1.846 |
53.908 |
0.143 2 |
0.049 |
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DS砂滤池3cm |
3.2×109 |
1.75×109 |
2.10×109 |
5.44×106 |
1.823 |
385.642 |
0.656 |
0.003 |
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DS砂滤池50cm |
4.6×109 |
2.63×109 |
3.11×109 |
6.96×106 |
1.751 |
446.352 |
0.675 |
0.003 |
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其中，对不同滤池滤料表面试验样品的基因拷贝数进行汇总，如图4所示。
对比图4中数据可知，各滤池内细菌数量高于古菌，均约为古菌数量的1.5倍以上，其中活性炭池中细菌16S rRNA是古菌16S rRNA的5倍之多，说明活性炭池中微生物以细菌占主导。活性炭池和DS砂滤池中的细菌基因拷贝数要远远大于MK砂滤池和填料滤池，其中DS砂滤池中细菌量又高于活性炭池，并且相对应的古菌基因拷贝数和细菌基因拷贝数的情况基本一致。
在氮转化过程中起到一定的作用的氨单加氧酶的amoA基因拷贝数与细菌规律基本一致，DS砂滤池中最高，活性炭池其次，然后是填料滤池和MK砂滤池。由各滤池中amoA/Arch-amoA均大于1，说明所研究的砂滤池、活性炭池和填料滤池中对氨氮转化起主导作用的仍是细菌这类菌群。并且DS砂滤池中amoA相对优势要高的多，说明DS砂滤池中对氨氮去除贡献最大的应该是氨氧化细菌。MK砂滤池中amoA和Arch-amoA数量相当，说明在MK滤池中氨氮的生物去除是靠两者共同实现的，但总数量相对较低。因此，滤料中amoA是细菌中对氨氮去除率贡献的基因，其中DS砂滤池内滤料表面的氨氧化细菌占细菌的比例最大，其次是填料滤池。
与此同时，对各滤池中目标微生物之间的比例关系进行对比分析，如图5所示。
由图5可知，DS砂滤池中细菌与古菌比例较稳定，MK滤池、填料滤池以及DS砂滤池中细菌16SrRNA与古菌16S rRNA比例接近且较稳定，而活性炭池中该比例明较高。对于古菌这类菌群来说，各滤池内氨氧化古菌占滤料表面古菌的比例均较低，低于5%，说明滤池内部的古菌中对氨氮去除有贡献的比例较小。其中，活性炭池中氨氧化古菌数量最多，但古菌的比例为4.6%，略低于填料滤池。
目前国内多数水厂仍采用常规水处理工艺，而该工艺对水中氨氮去除能力差，生物硝化作用是水中氨氮去除的主要途径，因此生物法去除水中氨氮已成为水处理的发展趋势。
本试验利用分子生物学技术对饮用水处理工艺中滤池内生物群落分布进行了初步探索，为生物硝化作用去除饮用水中氨氮提供了理论依据。通过Real-time PCR方法对不同滤料样品的微生物量和氨氧化菌进行初步探讨，发现氨氧化细菌在滤池硝化去除氨氮中起主导作用；DS水厂砂滤池滤料表面氨氧化细菌占细菌总数的比例最大；各滤池内氨氧化古菌占滤料表面古菌的比例均较低。
本研究围绕在常规工艺条件下饮用水氨氮去除难题，利用分子生物学技术对饮用水处理工艺中滤池内氨氧化菌分布进行了初步探索，为为我国解决类似饮用水污染问题和水厂工艺升级改造提供了有价值的研究和生产试验数据。
但是，本研究仍存在很多不足之处，后续工作还需进一步全面认识生物填料、砂滤池、活性炭滤池等介质体系下微生物群落结构及其空间、时间等条件下的分布与演变特征。
本文选自《净水技术》2017年第三期，阅读原文可登陆http://www.cnki.net/KCMS/detail/31.1513.TQ.20170331.1715.008.html。
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