【LorMe周刊】举足轻重：单一菌株对微生物菌群的掌控
作者：李婧璇，南京农业大学博士在读，主要研究合成微生物群落。
生物工程的范围正从单一菌株扩展到整个微生物群落的设计，从而实现分工合作、亚种群特化和与自然微生物群落相互作用。然而，在缺乏稳定相互作用的情况下，微生物之间的竞争会随着时间的推移不可避免地导致不适应的群落成员的消失。本文通过一个在竞争反应中分泌细菌素的工程大肠杆菌，利用偏害共生和竞争排斥使一个双菌株的群落达到稳定。通过实验和数学证明，这样的系统可以产生稳定的种群，其组成可以通过可控的参数进行调节。并且该系统只需要对单个菌株进行工程设计就可创建了一个可调的、稳定的双菌株组合。
细菌素可以远距离控制种群
该组合由一个生长快速的Escherichia coli MG1655竞争菌株和一个生长较慢、携带mcherry且可以通过分泌细菌素抵御竞争排斥的工程菌株E. coli JW3910组成（图1a）。当细菌素因突变而失活时，竞争菌株排除了工程菌株；而当细菌素完全表达时，工程菌株占据优势（图1b）。
图1 细菌素可以克服竞争性排斥
图2 工程菌群种群数量越多就能更快杀死竞争菌株
限制生长更有利于工程菌株
通过使用简单的数学模型模拟稳定环境中的生长动态和细菌素生产，结果表明，根据其起始成分和稀释率，共培养将倾向于排除其中一个菌株（图3a）。这说明通过控制稀释率，当前的群落组成可以在工程菌株或竞争菌株占主导地位的状态之间切换。虽然不能直接控制共培养的稀释率，但可以通过连续稀释共培养菌群并观察它们在不同初始种群密度下的动态来模拟稀释率对种群密度、生长底物和细菌素浓度的影响（图3b)。在初始种群密度最低的情况下，细菌素的初始浓度非常低，生长底物充足，这使得竞争菌株在工程菌株能够站稳脚跟之前就占据了种群的主导地位。随着初始密度增加，初始细菌素浓度和分泌细菌素的工程细胞数量增加，底物浓度降低，导致竞争菌株胜出的机会变小。这种情况下竞争排斥时间缩短，工程菌株占据主导的速率提高（图3b）。在特定的初始共培养比例范围内进行同样的实验（图3c），观察到的结果与模型模拟结果一致（图3a）。
图3 环境稀释可控制菌株的相对适应性
通过外源诱导扭转竞争优势
在某些应用上完全控制环境参数（如稀释率）是不现实的。因此需要另外的“开关”——通过控制一种群感分子N-3-氧-己酰高丝氨酸内酯（3OC6-HSL）的剂量来控制细菌素的产生，3OC6-HSL浓度越高，细菌素产量越低（图4）。
图4 外源控制细菌素产生
在细菌素产生率较低的情况下，竞争菌株占主导地位；而在较高的细菌素产生率下，工程菌株占主导地位（图5a）。在不同浓度3OC6-HSL下的共培养结果表明，随着3OC6-HSL浓度的增加，工程菌株对竞争菌株的杀伤力减弱，菌群组成向竞争菌株占主导转变（图5b）。这从竞争5小时后的种群变化也可以看出（图5c）。
图5 外源添加3OC6-HSL控制竞争
群落自主调节
根据上述结果，本研究进一步通过在工程菌株中添加3OC6-HSL合成酶基因的表达来控制细菌素的表达（图6a）。该系统需通过改变3OC6-HSL的浓度来感知和响应竞争排斥（图6b)。为了能够调整每个细胞的3OC6-HSL产生率，添加了驱动3OC6-HSL合成酶基因表达的阿拉伯糖诱导型启动子。阿拉伯糖浓度越高，诱导的3OC6-HSL合成酶表达越强烈。通过提高每个工程细胞的3OC6-HSL浓度，在较低的种群密度下达到关闭细菌素的阈值。系统使用模块化方法，荧光蛋白构建在每个启动子的下游使得每个组件的功能发挥在试验进展过程中均可测（图6c, d）。
图6 自主控制细菌素生产
该系统的稳态分析显示了稳定共存的区域，其大小取决于细菌素表达的释放（图7）。减少细菌素的释放使稳定共存的区域扩大，允许该组合在更低的稀释率和更大的群感分子产生率范围内保持稳定，提高共存的稳健性。重要的是，可以通过LuxI的阿拉伯糖诱导来改变3OC6-HSL的产生率，使系统控制在一个稳定共存的区域。此外，还可以利用3OC6-HSL的产生率来调整稳定共存区域内的种群比例，产生率越高，群落中工程菌株的比例越低。
图7 细菌素释放减少共存区域
根据图3的结果，可以认为在初始密度下，随着阿拉伯糖浓度的增加，在平板上进行共培养的动力学类似于稀释率0.4hr-1的情况（图8a）。一旦环境中不存在阿拉伯糖，工程菌株就会像预期的那样在占据主导地位。在10 mM阿拉伯糖中观察到了共存：约5 h后进入静止期（图8b），7.5 h时种群比例趋于稳定。
为了探究该系统能否长时间共存，进行了每2小时重复稀释并取样（图8c）。结果表明没有了阿拉伯糖，竞争菌株就会灭绝，有了10 mM阿拉伯糖，就能稳定的共存。在中等浓度的阿拉伯糖中，观察到了稀释率的效应，即较低的稀释率会导致竞争菌株灭绝。平板培养的结果表明共培养并没有达到稳态（图8e）。
图8 菌群能够达到稳态
确定菌群控制的稳定模型
由于只能在菌群中设计一种菌株，本文还尝试使用其他机制来替代或补充试验中使用的细胞间毒素：胞内毒素以前曾被用于种群控制，并且调节毒素免疫基因的表达能够改变菌株的生存能力。所有这些分子的表达可以是结构性的，受到工程菌株表达的群感分子的控制（图9a）。试验设计了一个由132个独特系统组成的模型空间，并评估候选模型产生稳定菌群的能力（图9b）。在同时考虑菌群共存和复杂性的前提下，结果表明所有表现最优的系统均有细菌素，而在不存在细菌素的情况下的最优系统仅排在第75位（图9c）。总的来说，最优的系统需要控制四种基因：被群感分子抑制的细菌素、免疫和抗毒素以及被群感分子诱导的细胞内毒素（图9d, i）。考虑到它们的相对简单性，不含细胞内毒素和抗毒素的系统表现得特别好。其中最好的方法是利用群感分子抑制细菌素和免疫（图9d, ii）。这会在较高的种群密度下减少对竞争菌株的杀戮，并增加工程菌株的敏感性。一种较简单的系统是只使用群感分子来抑制免疫基因（图9d, iii）。而要实现稳定的菌群，最简单的系统就是只需要群感分子对细菌素的抑制（图9d, iv）。这是因为免疫基因在该系统中表达，但由于其组成表达水平不需要调整，所以认为该系统比图9d,iii更简单。
图9 探索控制种群的可能模型空间以找到最佳系统
本文通过一株能够通过表达和分泌抑制竞争菌株的细菌素的工程菌株来控制菌群。并进一步设计该工程菌株以达到外源添加群感分子3OC6-HSL使细菌素剂量依赖性表达的目的。此外，该系统已达到自主调控，实现了种群密度从由工程菌株到竞争菌株控制之间的转变，并发现特定浓度的阿拉伯糖的添加使工程菌株和竞争菌株稳定共存。最后本文对该工程系统进行改进、简化，只需控制群感分子即可实现菌群稳定。这一结果为菌群设计提供了新的思路。
论文信息
原名：Single strain control of microbial consortia
译名：单一菌株对微生物菌群的掌控
期刊：Nature communications
发表时间：2021.03
通讯作者：Alex J. H. Fedorec, Chris P. Barnes
通讯作者单位：伦敦大学学院