淡紫拟青霉菌高产孢量的培养基

淡紫拟青霉菌高产孢量的培养基,其主要成分为200 g/L马铃薯+1%鸡蛋黄+20 g/L蔗糖,在该培养基中淡紫拟青霉菌在接种培养后6 d孢子浓度达到1 ml 7.017×109个。对孢子浓度和菌体含量之间、上清液毒力和上清液中蛋白酶活性之间的相关关系分析结果表明,孢子浓度和菌体质量之间的相关性较高,上清液毒力与蛋白酶活力之间的相关性较低。

根结线虫(Meloidogyne)在全世界分布广泛,其寄主范围广,危害 严重,受害植物一般减产 10%左右,严重的高达 75%以上,而且受害植 物更易受真菌和细菌侵染,成为诱发植物其他病害的重要原因之一。淡紫 拟青霉菌[Paecilomyces lilacinus(Thom)samson]是土壤及多种植物根系的 习居菌,同时是昆虫及植物寄生线虫的重要天敌,是一种极有价值的生防 菌。该菌对南方根结线虫(Meloidogyne incognita)的卵寄生率高达 60% ~ 70%。近年来,国内外相继开展了利用淡紫拟青霉菌对寄生线虫进行生物 防治的广泛研究,并筛选淡紫拟青霉菌优良菌株进行开发利用,生产商品 制剂。但是自然筛选的菌株寄生率不高,菌剂的防治效果偏低,限制了该 菌的开发利用,因此,诱变选育新的优良性状菌株具有重要价值。而选择 高效的诱变选育方法和探索最佳试验条件成为选育的关键和首要条件。 本研究(1)采用紫外线照射和化学诱变剂(硫酸二乙酯、氮芥和亚 硝酸)处理孢子的方法对淡紫拟青霉菌 IPC 菌株进行诱变,选育卵寄生率 提高的优良菌株,并对诱变和筛选方法进行了实践和探讨;(2)利用随机 扩增多态性 DNA(RAPD)分子标记手段对诱变的正、负突变菌株的遗传 多样性进行了检测;(3)对该菌原生质体的形成和再生条件进行了研究, 并进行了原生质体诱变,为将来通过原生质体诱变、融合、转化等进行菌 种选育、优化性状打下了重要的基础。主要研究结果如下: 1.采用紫外线照射和化学诱变剂处理孢子的方法对淡紫拟青霉 IPC 菌 株进行诱变选育。结果表明:4 种方法均产生对根结线虫卵具有较高卵寄 生率的菌株,其中选育优良菌株以紫外线照射处理为佳。最后筛选出 7 个 优良菌株 UV-307,UV-309,UV-14,UV-21,HN-402,HN-404 和 HN-407, 其卵寄生率比原始菌株提高了 15%～24.28%。7 个突变菌株培养特性都发 生了变化。 2.对淡紫拟青霉菌进行诱变选育南方根结线虫卵寄生菌的过程中, 首次采用几丁质酶产量和活力作为初筛标准,试验证明该筛选方法可以较 好地筛选出正突变菌株,减少了选育工作量。实验中还采用了菌株生活力 作为初筛标准,复筛检测正突变率为 77.3%,筛选效率很高。 3.利用 RAPD 分子标记手段对淡紫拟青霉 IPC 菌株及其诱变筛选的 - 1 - WP=10 淡紫拟青霉菌 IPC 菌株诱变育种研究 共 16 株正、负突变菌株进行分析,6 个引物对供试的 16 个菌株共标记产 生 114 条特异性的 DNA 谱带,多态检测率为 83.3%。利用 UPGMA 聚类 分析结果表明:供试菌株具有丰富的遗传多态性;应用 RAPD 技术可以快 速准确的鉴定菌株是否突变及突变程度。 4.研究了菌龄、渗透压稳定剂、酶的种类及浓度、酶解时间和再生 培养基等因素对淡紫拟青霉菌 IPC 菌株原生质体形成和再生的影响。结果 表明,IPC 菌株原生质体形成的最适宜条件是:菌龄 20h,用 5mg/mL 的 蜗牛酶,0.8mol/L NaCl 的渗透压稳定剂,酶解 2~3h。原生质体涂布于含 0.6mol/L NaCl、0.5%琼脂的再生培养基上,再生率最高。经过本试验研究, 淡紫拟青霉 IPC 菌株原生质体产量可以达到 106～107/mL,再生率 20%以 上。 5.对淡紫拟青霉菌 IPC 菌株的原生质体采用紫外线照射处理。结果 表明:紫外线照射处理 2min,原生质体的诱变致死率就达到 100%,诱变 选育优良菌株应该选用紫外线照射 30s 左右的诱变剂量,原生质体对紫外 线照射相对于孢子更加敏感。