Neuron | 更加灵活！艾伦研究所开发新的增强子病毒，实现亚细胞类型特异性标记

病毒工具使神经生物学家可以方便地实现细胞特异性地环路追踪和操控。

最近，艾伦脑科学研究所的Bosiljka Tasic团队在 Neuron 杂志在线发表了题为“Enhancer viruses for combinatorial cell-subclass-specific labeling”的文章。

该研究团队利用单细胞染色质可及性测序得到的细胞亚类的特征增强子数据开发了增强子启动的腺相关病毒，实现小鼠和人皮层的特定神经元类群多色标记。

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小鼠皮层的单细胞染色质

可及性测序（scATAC-seq）及数据识别

启动子筛查实验框架

研究人员对流式分选的单细胞进行ATAC-seq，他们选择检查投射到特定大脑区域的VISp神经元，通过逆追病毒和转基因小鼠结合，收集了60只小鼠的3602个单细胞。

经过指控筛选和与以往测序数据比对后，基于以往的转录组学分子，研究人员通过聚类分析算法将细胞数据分类成几簇，并用此前的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据检验，同时VISp不同层神经元脑区投射特异性的聚类和ATAC-seq的聚类相吻合。

使用细胞亚类特异性

增强子启动的病毒标记神经元

受发育调节的表观遗传选择性地增加基因组特定区域的可及性以实现特定的基因表达。增强子和其他远端调控元件可充当“形容词”，改变细胞类型特异性的基因表达权重，从而调节高度多样化和专门化的组织（如大脑）的构建。

研究人员在分类学的所有级别（类，子类和类型）的细胞组找到了一些特异性的增强子(mouse single-cell regulatory elements, mscREs)，并通过病毒验证其表达特异性。

这次研究集中于L5 PT，L5 IT，L6 IT Car3或L6 IT的亚细胞类群，因为目前尚无针对这些特定群的病毒遗传工具。

筛选mscREs有三个标准：（1）在目标皮层内标记（2）标记细胞的形态完好（3）转录组学验证ok。

最终在16个mscREs中，研究人员筛选出了mscRE4, mscRE10, mscRE13和mscRE16四个工具增强子。

增强子启动的重组酶

接下来，研究人员试图确定表达外源重组酶或转录因子的增强子病毒与转基因小鼠结合使用的情况，于是制作了表达不同重组酶的mscREs病毒，并打入相应的报告基因小鼠中。

之后研究者使用成像，RNAscope和scRNA-seq的方法检验了这些病毒标记的特异性和完整性，结果整理在补充表格中。

神经元亚类群的组合标记

为了简化育种和实验方案，研究人员测试了增强子病毒配合转基因小鼠组合使用同时标记多种细胞类型。于是他们将mscRE4-iCre（针对L5 PT神经元）和mscRE16-FlpO（针对L5 IT神经元）病毒共注射到Ai65F / wt; Ai140 / wt双报告基因小鼠中。

结果十分漂亮，在整个皮层中可以看见L5PT（绿色）和L5IT（红色）细胞的明显不同的标记（封面图）。

为了简化繁殖，研究者培育了Ai213报告小鼠，这是一种具有三种不同独立重组酶（Cre，Flp，Nigri）的小鼠，进一步展示了增强子病毒的共标潜能。

Ai213中的亚细胞类群共标

人离体切片中L5PT神经元的标记

最后，该团队也在人的离体脑片中测试了这些增强子病毒的适应性，使用mscRE4增强子标记了人新皮质切片中的L5 PT神经元，并通过电生理特性和RNA-seq进行了验证。

总 结

病毒工具可以标记和干扰特异性细胞类型，但是涉及的细胞类型是十分有限的，尤其是当分类细到subclasses和type上的时候。在这里Bosiljka Tasic团队将之前大量的scRNA-seq和scATAC-seq数据整合起来，建立了新的增强子病毒工具。虽然目前，这种病毒仍有来自滴度，给药方式，动物年龄等方面的限制，但其展现的潜力为亚细胞类群研究提供了新的可能性。

原文链接：

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0896627321001598?via%3Dihub#!

文献信息：

Lucas T. Graybuck, et al, Enhancer viruses for combinatorial cell-subclass-specific labeling, Neuron, 2021

编译作者：小鱼干（brainnews创作团队）

校审：Simon（brainnews编辑部）