科研 | Nature：根际微生物驱动磷酸盐胁迫与免疫的直接整合
本文由Jingzhi Zhang编译，董小橙、江舜尧编辑。
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植物生活在多样性的地球化学土壤中，这些土壤中蕴藏着及其丰富的微生物区系（根际微生物）。植物器官（根系）与这些微生物区系的部分微生物密切相关；土壤养分含量的改变可以影响这些微生物区系的群落结构。一方面根系微生物会与植物争夺土壤中的养分，同时它们也会相互竞争，而另一方面它们会提高植物的产量。目前尚不清楚植物免疫系统如何协调微生物识别与微生物组装过程中的营养线索。我们建立了一个控制磷酸盐胁迫反应的遗传网络，即使在非胁迫磷酸盐条件下，它也会影响根系微生物群落结构。我们定义了在合成细菌群落中调节营养和防御之间协调的分子机制。我们证明，拟南芥磷酸盐胁迫反应的主转录调控因子也直接抑制防御，这与植物将营养胁迫置于防御之上相一致。我们将致力于定义和部署有益微生物，确保植物健康。
论文ID
原名：Root microbiota drive direct integration of phosphate stress and immunity
译名：根际微生物驱动磷酸盐胁迫与免疫的直接整合
期刊：Nature
IF：41.577
发表时间：2017年
通信作者：Gabriel Castrillo
通信作者单位：美国北卡罗来纳大学生物系
实验设计
本实验在野外开展，我们在Mason 农场（北卡罗莱纳,美国;+ 35°53’ 30.40’’,− 79°1′5.37′′）[19]收集了没有被杀虫剂和肥料污染的的表从土壤（大约20cm），标注为MF。将处理好的土壤装入（2 ×2 平方英寸）方形罐子中，用来种植作物。土壤微量养分分析参照Lundberg, D.S等[19]。
本研究中使用的拟南芥突变体均来自哥伦比亚大学(Col-0)。详见补充表16。所有种子表面用70%漂白剂灭菌8分钟，0.2%吐温-20灭菌8分钟，用无菌蒸馏水冲洗3倍，以消除种子表面的细菌。种子在4°黑暗中分开。为了确定缺磷在控制微生物群落结构中的作用。我们分析了5个与磷—转运系统相关的突变体(pht1;1, pht1;1 pht1;4, phf1, nla, and pho2)和2个直接参与磷─缺乏感应调控的突变体(phr1和spx1 spx2)。所有这些根系都在根系中表达[13,18]。
种子在无菌方形花盆中萌发，花盆中装满如上所述的MF土。同时，我们也使用没有植物的花盆作为“大块土壤”对照。所有的罐子，包括对照组，都是每周2次用非无菌蒸馏水从顶部浇水，以避免氯和其他自来水添加剂的污染。植物生长在晚上16h，18°，白天8小时21°的生长室中7周。在所有实验中，根据大气噪声产生的真实随机情况，将含有不同基因型植物的花盆随机放置在托盘中；我们从www.random.org获取的这些数据。我们将托盘放置在生长室中，没有注意到它们所包含的花盆，也没有注意到花盆的标签，而是定期对它们进行重新洗牌。
取植物和对照土壤，分离了它们的内生菌室(EC)微生物群落[19]，DNA提取采用96孔格的Mo Bio Power Soil Kit (MOBIO Laboratories)试剂盒提取，按说明提取。
采用Ames[25]的方法测定不同磷处理的幼苗幼芽中磷酸盐的含量。采用Image J软件[26]测定主根长伸长，采用Win Rhizo软件[27]测定侧根面积和根数。
实验内容
1 植物根系微生物群落对磷酸盐胁迫的反应
我们通过比较野生型拟南芥Col-0与三种磷胁迫反应（PSR）突变体的根系细菌群落，将PSR与根系微生物组连接起来(图1a, b，补充文本1;扩展数据图1;补充表1)。PSR是在无菌苗中开展，并且测定植物茎中的磷浓度，其在这些突变体中是可变的。在富含磷和无菌条件下，phr1植物积累的游离磷比野生型少[13]。pht1;1, pht1;1 pht1;4 and phf1积累非常低的磷水平，并表达PSR[14, 15]，而pho2、nla和spx1 spx2表达不同程度的Pi超积累[16 - 18]。我们在先前描述的野生土壤[19]中种植物，土壤中没有明显的磷酸盐缺乏(扩展数据图2)。一般情况下，野生土壤中生长的PSR突变体的Pi浓度与无菌条件下的Pi浓度相同，除了phf1和nla的表型与无菌琼脂中观察到的相反，phr1的Pi浓度与Col-0相同(图1b)。这些结果表明，复杂的化学条件、土壤微生物或这些因素的组合可以改变突变体中的Pi代谢。
根内生细菌与之前的研究结果一致[2,19]。约束排序法表明，在这些PSR突变体所代表的Pi累积梯度上，细菌群落之间存在显著差异。[CAP分析，5.3%的约束方差]（图1c）。CAP分析表明，phr1和spx1 spx2具有不同的群落，这可以从它们在前三个排序轴上的分离得到证明，而Pi-transport突变体对phf1的影响最大(图1c)。与野生型相比，突变型植物根系内细菌的丰度不同。同一PSR类型的突变体在低分类水平上对根微生物组具有相似的影响[97%同一OTU](图1d)。而在更高的分类水平上，它们没有重叠效应(Family, Extended Data Fig. 1g)。这表明亲缘关系密切的细菌群体在相同宿主基因型上具有不同的定植模式。重要的是,我们发现PSR突变体信号类型可以很好的解释我们发现的浓缩和损耗文件，而不是突变体积累Pi的能力：所有的与Pi转运相关的突变体对根系微生物也有类似的影响，而相对的PSR控制基因phr1 spx1 spx2表现出独特的模式(图1 a、d和扩展数据图1 f,g)。我们的研究结果表明，不同PSR水平会影响野生土壤中植物根系微生物组的组成，导致不同浓度的Pi积累，其中特定微生物的丰度也会发生变化。
图 1
2 磷酸盐胁迫反应的微观构建
我们在野外土壤中的观察表明，PSR与微生物群落的存在之间存在复杂的相互作用。因此，我们从十字花科(几乎全部来自拟南芥)根和两种野生土壤中分离出35种分类学上不同的基因组测序，建立了一个易于操作但复杂的合成细菌群落(Syn Com)。我们将近似于野生型根内基因Syn Com观察到门水平分布(扩展数据图3，补充表1，补充表2)。我们将col0、phf1和双重突变的phr1 phl1 (phr113的冗余部分)幼苗接种在低或高Pi琼脂平板上(补充文本2)。12天后，我们注意到Syn Com对低Pi条件下生长的Col-0植株的茎Pi积累有负作用，而对富含磷酸盐条件下生长的植株没有负作用(图2a)。如预期，两种PSR突变体累积Pi均小于Col-0;Syn Com并没有修复这个缺陷。因此，在这个微观世界中，与植物相关的微生物推动了与植物相关的Pi竞争。
我们试图确定PSR是否被Syn Com激活。我们基于核心文献集合生成了一个包含193个PSR转录标记基因，并对其在转录实验中的表达进行了探究(扩展数据图4a, b，补充表3)。在无菌低Pi条件下，只有本构型Pi胁迫突变体phf1能够诱导这些PSR标记物。相比之下，与高Pi条件下生长的植株相比，Col-0植株对PSR标记的诱导能力较差(图2b)。这可以用蔗糖中关键成分vitro20的有意缺少对PSR的反应来解释，但是并不适用于联合使用扩展数据的Syn Com定植的协议。值得注意的是，Syn Com显著增强了colo -0中Pi饥饿的典型转录反应(图2b)；这依赖于PHR1和PHL1(图2b;扩展数据图4b)。相关对照证实了这些结论(补充案文2;扩展数据图4，6)。重要的是，用Syn Com在0或50M Pi上预定殖的植物的芽，在没有额外细菌的情况下，当随后转移到完全Pi条件时，累积的Pi是类似处理的非定殖植物的20 - 40倍(图2c和补充表4 )。这表明Syn Com可以激活PSR的功能。因此，我们认为，由Syn Com诱导的对低Pi的转录的反应，反映了复杂生物环境中正常PSR的一个完整的微生物过程。
我们评估了用Syn Com种植的植物的琼脂和根相关的微生物群（补充文本3；图2d，e；扩展数据图7e，f；补充表5）。与野生土壤中植物生长的结果一致，我们发现PSR突变体未能组装野生型Syn Com微生物群（图2f）。有些菌株在PSR突变体phf1和phr1 phl1（图2e，f；扩展数据图7c）、Pi浓度（图2g；扩展数据图7d）或样本分数（扩展数据图7b，e，f）上差异明显。这些结果建立了一个研究植物与植物相关微生物长期竞争下PSR的微观重构系统，并确认了所测试的PSR突变体影响根系部分微生物群落。
图 2
3 磷酸盐胁迫反应与免疫系统输出之间的控制
我们注意到phr1 phl1和phf1在我们的Syn Com存在下差异地激活转录PSR（图2b）。因此，我们研究了Syn Com中植物的转录组，以了解这些微生物是如何依赖phr1激活PSR的。我们鉴定了差异表达基因（DEG），这些基因对低Pi、Syn Com的存在或两者的组合（以下为PSR-Syn Com DEG）作出反应（补充文本4；扩展数据图8a,b，补充表6）。分层聚类分析(图3a，补充表7)表明，与phr1或phr1 phl1相比，Col-0中活化更强的基因集(c1、c2、c7和c10)。这些簇包含了大多数由PHR1调控的核心PSR标记(图3b)。在一项独立的Ch IP-seq实验中发现的PHR1直接靶点(图3c，补充表8)、PHR1启动子结合基序(扩展数据图4c)以及与PSR相关的生物学过程中涉及的基因(图3d和补充表9)也得到了富集。PHR1在植物免疫转录调控中发挥了重要作用。十二个聚类中的五个（图3a；c3、c6、c7、c8和c11）富含与植物免疫系统输出相关的基因；其中四个在茉莉酸（JA）和/或水杨酸（SA）通路标记（图3d、c3、c7、c8和c11；补充表9）中表现过高，其中三个四为PRO1直接靶向富集（图3C）。SA和JA是植物免疫激素调节剂，至少SA调节拟南芥根部微生物组成[2]。
为了进一步探索PHR1在植物免疫调节中的功能，我们在应用茉莉酸甲酯（Me JA）或SA类似物苯并噻二唑（BTH;补充表10）后产生了处理匹配的Col-0幼苗的转录组时程数据。我们发现PSR-Syn Com DEGs中SA和JA激活基因的过量表达（468对比SA预测为251，对JA预测为65对80; p <0.0001，超几何测试）（扩展数据图。8c-h，补充表7）。大部分SA响应基因在phr1和phr1 phl1中的表达强于Col-0; 这些经典SA依赖性防御基因强烈富集（扩展数据图8d，e）。第二组在phr1和phr1 phl1中表达较col0少的sa反应基因缺乏经典的sa依赖性防御基因，且对可能参与PSR的基因富集较弱(扩展数据图8d)。相比之下，大多数JA响应基因在phr1和phr1 phl1中表现出较低的表达（扩展数据图8g，h），包括已知或预测介导防御相关硫代葡萄糖苷生物合成的46个基因中的18个子集（扩展数据图。8I）[21]。这与最近的观察结果一致，即phr1在Pi胁迫期间表现出降低的硫代葡萄糖苷水平[22]。SA-和JA-上调基因的分析显示，直接的PHR1靶点富集(图3e)，与此相反，一些直接靶点富集的PHR1调控簇也富集了防御基因(图3c, d)。许多SA-和JA-应答基因是PSR-Syn Com DEGs（图3f;扩展数据图8c-h，补充表7）。因此，PHR1在我们的Syn Com触发PSR期间，直接调控植物免疫系统中一个意想不到的比例。
图 3
4 PHR1整合植物免疫系统输出和磷酸盐应激反应
我们测试了PHR1是否也在通常用于研究PSR的条件下控制植物防御基因的表达。我们在这些条件下对低Pi进行RNA-seq，在col0中识别出1482 DEGs，在phr1 phl1中识别出1161 DEGs(图4a, b;图9，补充表11)。我们的大量BTH / SA激活基因在phr1 phl1中也被上调，但在低Pi中也没有在Col-0中上调（图4a，b;补充表12）。这些与我们的Sym Com在phr1 phl1诱导的防御基因大量重叠（图4c;红色椭圆，113/337 = 33％;来自图3a的簇c3和c8）。至少14/113是直接PHR1目标（补充表12）。
为了证实PHR1在调控微生物反应中的作用，我们分析了暴露于鞭毛蛋白肽flg22的Col-0和phr1 phl1植物的转录谱。我们选择长期暴露于flg22以模拟与微生物组接触的植物的状况。我们发现phr1 phl1植物显示出比Col-0更高的flg22应答基因[23]的表达，而这与磷酸盐状态无关（补充文本5;图4d;扩展数据图9a，b;补充表11;补充表13）。这说明PHR1负调控由flg22引起的免疫应答。
我们假设phr1 phl1对病原体感染的反应会发生改变。phr1和phr1 phl1突变体对拟南芥分离透明单胞菌Noco2和丁香假单胞菌杆菌DC3000均表现出较强的抗病性(图4e, f)。因此，这些结果证实了PHR1直接调控PSR和植物免疫系统。
图 4
结 论
植物对磷酸盐胁迫的反应与富含微生物的土壤中的生命息息相关。我们证实了控制PSR的基因有助于正常根系微生物组的形成。令人惊讶的是，我们的Syn Com在有限磷酸盐培养的植物中增强了PHR1（PSR的主要调节因子）的活性。这导致我们发现PHR1是功能相关的植物免疫系统基因组的直接调节剂。尽管在PSR需要激活JA反应基因[24]，我们发现PHR1不太可能是这种反应的一般调节因子（扩展数据图9c-e，补充表12），而是可以微调特定生物背景下的JA反应。
我们证明PHR1（可能还有PHL1）直接调控PSR和免疫系统输出。我们提供了一个大体的解释，这与以前研究不同，即PSR和防御系统是协调的，并暗示PHR1是关键的调节器[8,11,12,24]。我们提供了植物营养应激反应、免疫系统功能和微生物群落组成和维护的交互的新见解;以及在自然和农业环境中同时和协调行动的系统。我们的研究结果将推动利用微生物提高磷酸盐使用效率的方面。