科研 | 艰难梭菌感染机制与菌群失调有关
本文由木子依虫编译，董小橙、江舜尧编辑。
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肠道菌群在病原体防御中起着关键作用。使用抗生素治疗小鼠的研究揭示了宿主对艰难梭菌感染（CDI）的易感性增加的机制，而由CDI引起的危害甚至比抗生素滥用还严重。本文研究了腹泻患者的肠道菌群，并通过粪便移植到无菌小鼠中。当用艰难梭菌（C. difficile）感染时，移植了腹泻患者菌群的无菌小鼠中氨基酸浓度明显增加且对CDI有更大易感性，且其主要机制与宿主肠道的游离氨基酸浓度有关，尤其是脯氨酸。不能利用脯氨酸作为能量来源的艰难梭菌突变体不能感染移植健康者肠道菌群的无菌小鼠；使用低脯氨酸或低蛋白饮食能有效的预防艰难梭菌在肠道内的定植，降低感染发病率。此外，本文还提供了五种临床检测指标，用以评估艰难梭菌感染的风险。
论文ID
原名：Clostridioides difficileuses uses amino acids associated with gut microbial dysbiosis in a subset of patients with diarrhea
译名：艰难梭菌利用氨基酸与部分腹泻患者的菌群失调有关
期刊：SCIENCE TRANSLATIONAL MEDICINE
IF：16.796
发表时间：2018年10月
通信作者：Purna C. Kashyap
通信作者单位：Mayo Clinic, Rochester, MN, USA.
实验设计
实验选取了健康和腹泻患者的粪便样本，通过菌群结构分析，得出腹泻患者中有部分患者菌群失调，归为失调组；部分患者虽有腹泻但菌群结构与健康者相近，归为类健康组。通过菌群移植的方法将两组菌群移植到无菌小鼠中，加以艰难梭菌感染，分析两组小组肠道内艰难梭菌的定植情况和被感染后炎症的发病情况，结果失调组具有更大的易感性。为分析其机制，用转录组和代谢组学的方法，分析了HUMA-nN2通路中基因的表达情况，发现该现象与氨基酸利用有关。从而进一步明确了艰难梭菌能利用脯氨酸作为能源在宿主定植，引发疾病的机制。通过靶向降低宿主肠道内的脯氨酸含量，能有效的预防艰难梭菌的感染。
试验内容
1. 腹泻患者和健康者的肠道菌群组成有显著差异
115例腹泻患者和118名健康者粪便经16SrRNA测序，根据菌群结构分析结果将样本分为三类：健康组、健康但腹泻组（类健康组）、菌群失调且腹泻组（失调组）（healthy、healthy-like with diarrhea、dysbiotic with diarrhea）。其中健康和类健康组相似度大于菌群失调组，类健康组的菌群和失调组之间也有显著性差异，菌群失调组肠球菌、肠杆菌、卵杆菌和粪细菌、玫瑰花菌、紫苏菌和类杆菌都比其他组多。但是菌群失调组和艰难梭菌感染后的患者的菌群相似度较高，说明菌群结构的改变和腹泻本身没有关系。
图1. 三类样本菌群结构分析图
2. 失调组的肠道菌群比类健康组对艰难梭菌更敏感
将类健康组和失调组的菌群移植至无菌小鼠体内，加以艰难梭菌感染，待其成功定植后通过16SrRNA测序，失调组的艰难梭菌与类健康组相比，感染定植的艰难梭菌明显增多，且该组小鼠的炎症和其他炎症因子水平也明显高于类健康组。为确定艰难梭菌感染的诱发机制，比较了失调组和类健康组小鼠肠道菌群组成在艰难梭菌干预前、后2天的变化。16SrRNA测序法结果表明两组在干预前后均无明显差异。
图2 类健康组和失调组菌群移植后且感染后，小鼠肠道菌群的测序结果
3. 游离氨基酸的增加暗示肠道菌群代谢的改变
综合运用转录组和代谢组学技术评估菌群功能，即用RNA-seq分别对失调组和类健康组小鼠的菌群进行分析；选用HUMA-nN2通路对其关键因子的表达进行测定。结果显示该通路多个与氨基酸利用相关的基因表达水平都明显出现失调组高于类健康组的情况。基于此，本文进一步使用靶向核磁共振（NMR）技术分析了两组小鼠菌群在艰难梭菌干预前后的变化，结果发现与类健康组小鼠相比，失调组小鼠12种氨基酸含量显著升高，且脯氨酸含量差异最大（图3）。通过体外实验，在艰难梭菌的基础培养基上增减氨基酸的量，艰难梭菌的生长呈现出与氨基酸含量密切的相关性（图4）。
图3 失调组和类健康组小鼠的氨基酸利用水平差异明显
图4 艰难梭菌生长于氨基酸含量相关性研究结果
4. 在失调组小鼠中，利用脯氨酸为艰难酸菌的生长提供竞争性优势
RNA-seq基因表达谱显示，prdA（一种脯氨酸分解途径的重要酶）在艰难梭菌感染前均有大量表达，干预后，两组小鼠中均检测到prdA的表达，但结果显示，类健康组的脯氨酸被其他三类菌利用，且无艰难杆菌的prdA特异性表达，说明在类健康小鼠中，艰难杆菌不能分解利用脯氨酸，而失调组的脯氨酸基本被艰难杆菌属利用。将prdB（一种不能分解脯氨酸的酶）基因转入艰难梭杆菌，得到一株不能利用脯氨酸突变株，用该菌株去感染类健康组和失调组，能显著减少艰难梭菌的定植（图5），由此说明利用脯氨酸为艰难梭菌的定植提供了优势条件。
图5 艰难梭菌突变株在体内定植与检测情况
5. 通过体内靶向降低脯氨酸的浓度能降低失调组小鼠对艰难梭菌的敏感性
通过菌群移植的方法，将健康者的粪便移植到失调组小组体内，经16SrRNA测序分析，失调组体内的菌群结构有了明显变化，其组成和丰度都有了明显提升。加入艰难梭菌干预后，未见有艰难梭菌定植，且6天后没有被感染的迹象，表明移植健康者的粪便能保护失调组免收艰难梭菌的感染。同时，运用NMR技术检测了移植前后及干预前后的游离脯氨酸含量，发现移植后脯氨酸的含量明显下降，不利于艰难梭菌的定植。
6. 指出菌群失调者是否易受艰难梭菌感染的五个临床检测指标
基于艰难梭菌能利用游离脯氨酸在宿主定植，提出5个指标用于艰难梭菌感染的早期检测及预防（图6）。
图6 是否易受艰难梭菌感染的五个临床检测指标
结 论
本文通过分析腹泻患者的肠道菌群结构，发现腹泻患者根据菌群是否失调可分为类健康组和失调组，将这两组的菌群移植到无菌小鼠体内，同时加以艰难梭菌感染，结果失调组小鼠易受感染，且其主要与艰难梭菌能利用脯氨酸作为能量来源有关。
评 论
本文的研究结果不仅指明了菌群失调的腹泻患者更易被艰难梭菌感染，还通过转录组和代谢组学的方法证明了该机制：菌群失调的患者肠道微环境中游离氨基酸浓度较高，尤其是脯氨酸，艰难梭菌能利用脯氨酸作为能量供源，在肠道内定植，继而引发感染系列炎症。鉴于此，文中提出一种靶向降低肠道中脯氨酸浓度的方法，能防止艰难梭菌的定植，预防感染，为临床上预防艰难梭菌感染，降低感染发病率提高参考。