科研 | 活跃层冻土解冻和冻结过程中细菌和原生动物的动态变化
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导 读
由于北极地区覆盖多年冻土的土壤活动层由于受到温度和土壤化学年际变化的影响，因此提出一点假设，即这些变化会影响整个冻土层的土壤微生物群落。基于这点假设，笔者探究了Svalbard地区的活跃层土壤变暖和冻结过程中不同温度下土壤微生物的变化情况。通过对土壤总RNA进行提取测序发现，从−10°C升温到−2°C或从−2冷冻到−10°C时，土壤微生物群落没有发生变化。相反，在从−2变暖到+2°C的几天内，真菌rRNA的减少，同时属于Gemmatimonadetes，Bacteroidetes以及Betaproteobacteria的几种OTUS的增加。在2°C孵育16天时发生了更大的变化，真菌总的潜在活性下降，同时寡养细菌如Actinobacteria以及Acidobacteria减少；Bacteriodetes，Firmicutes，Betaproteobacteria以及Gammaproteobacteria的转录本序列有所增加。由于通过放牧捕食细菌群落，笔者还检测到细菌异养鞭毛虫的数量增加。虽然这种放牧活动可能解释了细菌群落组成的较大变化，但在培养过程中没有观察到16S rRNA基因拷贝数的变化，而且总RNA水平保持稳定。
论文ID
原名：Bacterial and protozoan dynamics upon thawing and freezing of an active layer permafrost soil
译名：活跃层冻土解冻和冻结过程中细菌和原生动物的动态变化
期刊：The ISME Journal
IF：9.520
发表时间：2018
通信作者：Carsten Suhr Jacobsen
通信作者单位：University of Copenhagen
实验设计
实验选取Sassendalen地区的一个活跃层土壤，除去积雪后，采集土芯（0-14厘米深），直径8厘米，随后低温保存以防止其解冻。实验前消毒杀菌所有仪器以避免污染，植物覆盖物从土壤表面收集，随后将土芯破碎，采用无菌孔头取样，在无菌塑料袋中粉碎。实验样品在-10°C预孵育48 h，然后在6天内逐渐升高到+2°C，随后+2°C培养16天，之后6天内降低至-10°C。在解冻阶段，每隔两天在−10、−6、−2和+2°C采集样品，分别为T−10°C、T−6°C、T−2°C和T2°C。在+2°C下16天后，在冻结期以两天间隔+2、−2、−6和−10°C采集样品，分别为F2°C、F−2°C、F−6°C和F−10°C。在8个取样点中，5个样品被快速冷冻在液氮中，然后保存在−80°C处，用于RNA提取和后续分析。
实验结果
1 土壤理化参数
样本在培养期间的平均温度随培养时间的变化如图1所示。温育期间的温度测量有≤平均值0.1°C的标准误差。由于需要打开容器，因此每次对样品采集后温度都会有稍许上升。培养前测定的土壤理化性质如下：土壤含水量39.6 ± 1.4%，总碳7.19 ± 0.32%，全氮0.48 ± 0.02%；土壤质地分布为粘粒（<2µm）3.1 ± 0.4%，粉土（2-63µm）55.4 ± 5.7%，砂粒（>63µm）41.5 ± 6.2%。在T−6°C、T2°C、F2°C和F−6°C下，土壤pH分别为7.5 ± 0.02、7.6 ± 0.04、7.4 ± 0.03和7.4 ± 0.00。
图1 活性层样品的培养温度。图中为5个重复间的平均值，平均≤0.1°C的标准误差。灰色箭头显示提取RNA样本的取样时间。
2 RNA浓度和16S rRNA基因转录本
DNA酶处理后，各样品间RNA含量差异不显著（ANVOA，p=0.06），但冷冻样品中RNA含量略高。所有样品RNA浓度为1.19 ± 0.0 4 µg g-1（鲜重）。各采样点16S rRNA拷贝数差异不显著（ANVOA，p=0.06），转录本平均拷贝数为2.92 ± 0.5×108g−1（鲜重）。16S RNA基因拷贝数在不同样本间差异不显著（ANVOA，p=0.06），16S rRNA基因拷贝数为1.60 ± 0.5×108g-1土壤。
3 微生物群落总体组成
为了探究微生物群落组成，从每个样本中随机挑选了200万个rRNA转录本，平均读数为785,989 ± 2972（n=32）。共检测到9763个不同的OTUs，其中细菌和古菌7154个，真菌651个，其他真核生物1958个。该群落的组成包括原核生物、真菌和微真核生物（图2），其中细菌占总读数的84.0−94.1%，古菌占比0.05−0.15%，真菌占比0.6−6.7%，Rhizaria占比0.5−2.6%，Viridiplantae占0.2~5.2%，其他真核生物占2.7~3.3%。在总的分类学水平上（图2a），只有真菌的相对丰度随温度的升高而显著下降，从6.7 ± 0.5%下降到4.1 ± 0.1%（ANOVA，p=0.037）。相比之下，所有这些主要分类群的相对丰度在2°C培养16天时发生了显著变化，其中三个组分在两次样本采集时有所增加，细菌由88.5 ± 0.4上升到93.6 ± 0.3%、Chromalveolata由0.16±0.01上升到1.16±0.06%，Rhizaria由0.62 ± 0.04上升到2.61 ± 0.23%。同时三个组分有所下降，其中包括真菌（4.08 ± 0.10%下降到0.58% ± 0.10%）、后生动物（0.81 ± 0.28%下降到0.12% ± 0.01%）、Viridiplantae（3.23 ± 0.34%下降到0.30% ± 0.06%）。根据实际计数计算的细菌和真菌的读数比率，在T2°C和F2°C之间，从17.4± 1.0增加到156.8 ± 9.4（ANVOA，p<0.0001，n=16）（图3）。
图2 在解冻和冻结过程中活跃层永久冻土中微生物群落的三个主要群落的变化。该图谱代表从总RNA序列中提取的小亚基RNA序列，条形图显示每个组的相对丰度。
图3 基于原始数据计算的细菌和真菌小亚基(SSU)rRNA读数之比。黑点是计算出的细菌和真菌分配的读数之间的比率的四个重复。黑线是四个重复中平均值。a代表土壤整体群落；b代表细菌和古菌群落；c代表真菌群落；d代表微真菌群落。
3.1 原核生物群落组成
在2°C的两个采样点之间，原核门水平和Proteobacterial类的相对丰度发生了很大的变化（图2b）。在此期间，大多数类群的丰度显著下降，其中包括Betaproteobacteria，Gammaproteobacteria，Firmicutes以及Bacteroidetes。在冻结样本中，Firmicutes门中Paenibacillus属为主要优势细菌，占37.3 ± 1.20%。Betaproteobacteria的相对丰度从5.95 ± 0.09%增加到32.26 ± 0.44% ，Gammaproteobacteria的相对丰度从2.15 ± 0.05增加到7.48 ± 2.29%。相反，在2°C的两个采样点之间，Acidobacteria和Actinobacteria的相对丰度分别从11.20 ± 0.09和18.98 ± 0.14下降到4.91 ± 0.34%和8.75 ± 0.71%。当温度从−10升高到+2°C时，仅有Gemmatimonadetes，Bacteroidetes和Betaproteobacteria的相对丰度不断增加。而当温度从−2到−6°C之间，仅有Aquificae是唯一对冻结过程便显出有显著反应的细菌门（p=0.03）。
3.2 真菌群落组成
Pezizomycetes和Agaricomycetes是主要优势真菌，他们的相对丰度在解冻和冻结过程中分别为29.8 ± 0.8%，27.8 ± 2.3%和49.8 ± 1.3，26.3 ± 2.3%（图2c）。真菌的总体趋势是18S rRNA拷贝减少（图2a），基于EdgeR检测分析发现，真菌OTUs序列中有97.2%的相对丰度在2°C培养16d期间明显下降；相反，包括Unclassified Mucoromycotina，Zygomycete sp. AM-2008a，Tetracladium Marchalianum，T. setigerum，Mortierella parvispora以及Nephridiophaga blattella在内的有6个真菌OTUs序列（约占0.2%）相对丰度有所升高。
3.3 微真核生物群落组成
微真核生物群落是指不包括真菌和植物的真核生物群落。在解冻或冻结过程中，各主要类群均无明显变化（图2d）。但除Excavata外，其余各组的相对丰度在2°C培养16d期间均有显著变化（p<0.05）。其中Rhizaria的相对丰度从16.0 ± 0.9增加到45.3 ± 2.73%，Chromalveolata的相对丰度从4.3 ± 0.2增加到22.4 ± 1.3%。Alveolata和Metazoa的相对丰度分别从27.1 ± 1.3和17.3 ± 2.9%下降到13.7 ± 2.0和2.3 ± 0.4%。
4 α和β多样性
通过研究发现，与冻结过程相比，解冻过程具有更高的多样性的明显效果。温度变化对α多样性没有明显影响，但解冻和冷冻样品的丰富度和Shannon指数显著降低，分别从4075 ± 31和5.1 ± 0.0下降到3761 ± 49和4.5 ± 0.1（p<0.05）。
在β多样性方面，各温度条件下样品的非随机分布（图4），其中第一组分解释了55.67%的变异度，并清楚的说明了不同处理（解冻和冻结）对RNA的影响，第二组分解释了8.96%的的变异度，主要是将T2°C样品与T−10°C、T−6°C和T−2°C样品分离。
基于Bray-Curtis的PERMANOVA同样可以证明，其中62%的变异度归因于解冻和冻结（p<0.0001），尽管变化的温度没有显示任何显著的趋势（4-8%的变异度）。对真菌和微真核菌群落进行了相似的分析，在解冻样品和冻结样品中观察到了相同的模式，但在不同样本之间都没有明显的趋势。
图4 土壤微生物群落群间分析(BGA)。图中显示了基于解冻和冻结过程汇总各样本按不同分组的主成分分析(PCA)。
5 原核生物功能反应群
我们探究了解冻样品（T−10°C，T−6°C，T−2°C和T2°C）和冻结样品（F−10°C，F−6°C，F−2°C和F2°C）中原核生物在OTU水平上的相对丰度的变化。在解冻过程中，62个OTUs的相对丰度发生了显著变化（负二项回归，p<0.05）。在土壤解冻样品中，确定了四个不同的组，代表四个不同的反应。每个原核功能反应群（FRGS）在门水平上都含有特殊的OTUs（图5）。其中当温度高于-2°C时，FRG 1和FRG 3对温度升高均呈负相关关系。FRG 1在T−2°C之前呈上升趋势，在T2°C时呈下降趋势，而FRG 3中的OTUs在整个解冻过程中随温度的升高而逐渐下降。FRG 1包括16个OTUs，以Actinobacteria为主，占全部OTUs的92.1%。FRG 3由10个OTUs组成，以Actinobacteria为主，占总OTUs的83.5%。FRG 2和FRG 4代表OTUs序列，当温度从−2增加到+2°C时，其相对丰度增加。FRG 2（包含19个OTUs，主要以Gemmatimonadetes为主），在整个解冻过程中呈上升趋势。FRG 4中的OTUs的相对丰度在T−10°C和T−2°C之间下降，而在T2°C时增加，这一组分中包含16个OTUs，其中Bacteroidetes和Proteobacteria分别占中OTUs的49.5%和31.4%。
图5 对环境变化有相似反应的一组有机体的四个不同的功能反应群（FRGs）的组成和丰度。该图代表了在解冻和冻结过程中，不同温度下的FRGs的系统发育类群的加权丰度。
6 16S基因拷贝数及其对解冻的响应
为了验证细菌16S rRNA基因拷贝数对解冻的响应的相关假设，基于每个样本OTU的相对丰度的加权计算了16S rRNA基因拷贝数，其中平均16S rRNA基因拷贝数显著增加，从解冻时的2.19 ± 0.00增加到冷冻后的3.35 ± 0.05（图6）。解冻样品和冷冻样品的OTU相对丰度与16S rRNA基因拷贝数之间的具有线性关系，说明基因拷贝数在这种线性关系中解释了10.2%的变异度（p<0.0001，图7）。
图6 不同时间点每个基因组的4个重复的平均16S rRNA基因拷贝数。
图7 基于PICRUST算法计算的T2°C和F2°C之间变化的点图和每个操作分类单元(OTU)的16S拷贝数的关系。红线为线性回归方程。
结 论
基于RNAseq的方法使我们能够调查土壤微生物群落中所有主要成员在解冻和冻结过程中的动态变化。土壤解冻并在2°C保存16天后，微生物群落发生了显著变化，例如真菌潜在活性急剧下降。对于细菌来说，这些变化可能与不同细菌分类群的潜在共营养和低营养生活方式有关，即使在解冻后1.5天内，潜在活性共营养细菌的相对丰度也增加，表明这些细菌群对解冻有快速反应。随着共营养细菌数量的增加，异养鞭毛虫对细菌的摄食也随之增加。这些观察结果使我们假设，原生动物的放牧不仅限于共营养细菌的激增，而且还可能影响到在植物凋落物和土壤有机质降解中具有重要作用的推定的寡营养细菌的分类群。因此，潜在真菌活性的降低和原生动物可能放牧细菌的共同作用，有可能延缓活跃层土壤解冻时更为复杂的有机物的降解。
评 论
北半球地区有近20%的土壤受多年冻土影响，其土壤中所存留的碳量是大气土壤的一半以上，而北极地区目前的气温上升速度高于全球平均水平，这将对冻土层造成影响。尽管冻土层多数情况下保持在极端环境中，但其中土壤解冻与冻结过程会造成微生物的动态变化。探究微生物对解冻和冻结的响应，可以进一步了解土壤微生物对环境的响应。通过研究作者发现，从−10°C升温到−2°C或从−2冷冻到−10°C时，土壤微生物群落没有发生变化，相反，在从−2变暖到+2°C的几天内，真菌rRNA的减少。基于本研究，对进一步理解北极土壤中植物养分的有效性和CO2排放有一定的意义，同时本研究也是首次应用TotalRNA技术对原核生物和真核生物群落进行了土壤解冻和冻结的综合生态评价。评价仅是小编的个人看法，欢迎大家一起进行讨论。
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