科研 | Cell子刊：肠道IL-17R信号通过调节微生物代谢产物抑制IL-18驱动的肝脏炎症反应
编译：莫沉，编辑：小菌菌、江舜尧。
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研究表明，IL-17信号转导途径经肠上皮细胞进而调节肠道微生物。基于已报道的肠道菌群失调、细菌易位和肝脏疾病之间的联系，研究者假设肠道IL-17R信号传导在减轻肝脏炎症方面起着关键作用。
为了验证上述假设，研究者在动物驱动型肝炎模型中，研究肠上皮特异性IL-17RA缺陷小鼠，在初始状态下，这些小鼠表现出菌群失调和细菌产物(CpGDNA)移位增加，从而促进肝脏产生IL-18。
在炎症诱导时，肠内IL-17RA信号的缺失会加剧肝炎和肝细胞死亡。IL-18是炎症加重所必需的，并且与基于IFN-γ和Fasl表达的活化的肝淋巴细胞增加有关。因此，肠道IL-17R调节TLR9配体的易位并抑制对肝炎的易感性。
上述研究将肠道Th17信号传导与肝炎中的微生物紧密地联系起来，对肠道免疫受损的影响以及随后在其他肠道外疾病中观察到的微生物相关代谢产物的释放具有更广泛的影响。
论文ID
原名：Intestinal IL-17R Signaling Constrains IL-18-Driven Liver Inflammation by the Regulation of Microbiome-Derived Products
译名：肠道IL-17R信号通过调节微生物代谢产物抑制IL-18驱动的肝脏炎症反应
期刊：Cell Reports
IF：7.815
发表时间：2019.11
通讯作者：Jay K. Kolls
作者单位：美国匹兹堡大学医学院免疫学系
肠道IL-17RA信号的破坏导致微生物群失调和细菌产物，特别是未甲基化的CpGDNA移位到肝脏, 促进IL-18的产生以及随后的淋巴细胞活化和细胞死亡，从而加剧了肝脏炎症
实验内容
1 肠上皮中IL-17RA的缺失加剧肝炎症状
图1 肠上皮IL-17RA缺失加重肝炎症状. (A) ConA处理后4h血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)(10 mg/kg)。(B) ConA(10mg/kg)后24h生存曲线. (C)Con A处理后8h TUNEL染色定量(25 mg/kg).(D)Con A(25 mg/kg)处理后8h TUNEL染色肝组织学病理图片。
2 恶化的肝损伤依赖于肠道菌群
鉴于Th17细胞在调节肠道微生物中的作用，研究者测试了加重的肝损伤是否是菌群依赖性的。在ConA注射前，将同窝出生的小鼠鼠Il17rafl/flxvillin cre+小鼠和Il17rafl/flcontrol小鼠同笼饲养或按基因型分离1周。当分开时，通过ALT测量，敲除鼠继续显示出更严重的疾病(图2A)。在小鼠之间同笼饲养的小鼠以共享肠道菌群从而消除了ALT水平的显著差异(图2B)，这表明肝炎症状的恶化是微生物依赖的。对窝仔鼠Il17rafl/flxvillin cre+小鼠的小肠末端回肠进行了16S rRNA基因测序，以检查由于IL-17R缺乏而引起的微生物群落的变化(图2C)。在未处理状态下观察到在Il17rafl/flxvillin cre+小鼠中SFB的生长，在conA处理之后变得更加明显(图2C)。此外，在conA之后之后，在一些Il17rafl/flx villin cre+小鼠中也有Enterobacteriaceae的生长(图2C)。
为了广泛评估哪些细菌可能导致肝病，在ConA处理之前用2种不同的抗生素方案处理小鼠。小鼠要么接受新霉素，主要针对革兰氏阴性菌，要么接受万古霉素，主要针对SFB和其他革兰氏阳性菌。基于ALT，新霉素对小鼠有保护作用，而万古霉素没有作用，表明革兰氏阴性细菌在这个模型中对肝炎有贡献(图2D和2E)。通过16S qRT-PCR对naive Il17rafl/flxvillin cre+小鼠和窝仔对照小鼠肝脏的初步评估显示，肠道特异性敲除小鼠的16S rRNA基因信号增加(图2F)，表明这些小鼠的肝脏中存在更多的细菌或细菌产物，同时肝脏中CpG DNA也有所升高(图2G)。血清中未见升高的CpG DNA(图2H)，这表明肝脏成功地过滤了进入循环的产物，而CpG DNA可能通过肝脏局部的TLR9发出信号来影响肝脏炎症。
图2 恶化的肝损伤依赖于肠道菌群. (A和B)窝仔鼠IL17rafl/fl和 Il17rafl/flxVillin cre+小鼠共居或分离1周。然后用刀豆蛋白A(ConA) (25mg/kg)处理小鼠，8h后测定血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)(n=6-14只/组)。(C)仔鼠IL17rafl/fl和 Il17rafl/flxVillin cre+小鼠在幼稚状态和ConA (25 mg/kg)后8h的末端回肠16S序列测定(n=7-16只/组)。(D和E)小鼠随机饮用饮水中1g/L的新霉素(D)或0.5g/L的万古霉素(E)，治疗时间分别为5d和14d。然后小鼠注射conA，在注射后8~9h测定血清ALT。(n=4-小鼠/组)。(F)用qRT-PCR方法测定幼仔IL17rafl/fl和 Il17rafl/flxVillin cre+小鼠(n=7-10只/组)肝脏中16S rRNA的转录组。(G和H)肝组织匀浆(G)和来自幼小鼠IL17rafl/fl和 Il17rafl/flxVillin cre+小鼠的血清(H)被接种在mTLR9 SEAP报告细胞上。
3 肠道IL-17RA抑制TLR9诱导的肝脏I型免疫应答
Cpg DNA和随后的TLR9信号能够诱导多种炎症细胞因子，如IL-12，IL-6和干扰素。为了研究哪些CpG诱导的细胞因子可能导致恶化的肝病，首先要确定哪些细胞因子在Il17rafl/flxvillin cre+小鼠中升高。研究者鉴定了12个不同的细胞群体(图3A)。在许多细胞群体中，Ifng是Il17rafl/flxvillin cre+小鼠中显著上调的基因之一(图3B和3C)，而肝脏IL-17，其他辅助性T细胞因子和以前在Con A中涉及的各种细胞因子没有显著差异。在scRNA测序数据集中，Ifng由自然杀伤(NK)细胞以及CD4，CD8和NK T细胞表达(图3A和3C)。下游的IFNg靶基因，如Cxcl9和Cxcl10也有所升高(图3B)，提供了IFNg表达上调的进一步证据。为了在蛋白质水平上证实这一点，我们在小鼠原始状态和ConA注射后5小时进行了流式细胞仪测定(图3D和3E)。与同窝对照组相比，Il17rafl/flx villin cre+小鼠在Con A处理后肝脏中有更多的IFNg+细胞(图3D和3E)。
为了证实CpG DNA可以诱导肝脏IFNg的升高，用增加浓度的CpG DNA或其他TLR配体刺激来自野生型C57BL/6小鼠的肝脏单个核细胞。为了评估这些配体是否能与con A协同作用，研究者测试了每个TLR配体在有或没有conA的情况下。发现CpG DNA、LPS和脂磷壁酸(一种TLR2配体)，都诱导IFNg的升高(图3G)。相反，TLR5配体鞭毛蛋白则不能诱导IFNg的升高(图3G)。上述数据证实了CpG DNA是IFNg的有效诱导剂，并提示CpG DNA可能不仅有助于在Il17rafl/flx villin cre+小鼠中观察到IFNg分泌的升高，而且还在体内与Con A协同作用以增强反应和加重肝脏炎症。通过流式细胞术，单独在培养基中培养的Il17rafl/flxVillin cre+肝细胞中IFNg+细胞已经略有增加(图3H和3I)，该结果支持了前面的假设，即基线时升高的CpG DNA可能在局部诱导炎症细胞因子。综上所述，这些数据表明，除了在基线时Il17rafl/flxvillin cre+小鼠的肝脏中有更多的CpG DNA外，肠道特异性敲除还显示出IFNg的基线低水平升高和对CpG DNA的增强反应。
图3 肠道IL-17RA抑制TLR9诱导的肝脏I型免疫应答. (A-C)静脉注射后90分钟。刀豆蛋白A(25 mg/kg)，对IL17rafl/fl和 Il17rafl/flxVillin cre+肝细胞进行单细胞RNA测序(n=2只小鼠/组)。(A)基于降维和细胞特异性基因表达的细胞类型聚类的t-分布随机邻接嵌入(t-SNE) (B)Ifng、Cxcl9、cxcl10log基因表达的聚类t分布随机邻居嵌入(t-SNE)，以及在Il17rafl/fl(” Neg”)和Il17rafl/flx Villin cre+(“pos”)肝数据集中经Cxcl10 log转化的基因表达。(C) IL17rafl/fl和 Il17rafl/flxVillin cre+数据集中IFNG表达细胞的t-SNE，根据相对表达水平着色。(D和E)流式细胞术分析幼稚状态和ConA (25 mg/kg)后5h的窝仔鼠IL17rafl/fl和 Il17rafl/flxVillin cre+小鼠的肝细胞(n=2-4只/组)。(D)代表的流式细胞图。(E)活的IFNG+细胞、IFNG+ TCRb+细胞、IFNG+TCR-细胞和IFNG+NK细胞的数量(CD90+ TCRb-NK1.1+设门)。(F)肝细胞总数以Il17rafl/fl(n=3-16只/组)的倍数变化表示。(G)收集野生型C57BL/6小鼠肝脏，富集单个核细胞。用不同浓度的TLR配体(脂磷壁酸[LTA]，鞭毛蛋白[Fla]，脂多糖[LPS]，或CpG)±conA(5 mg/mL)体外刺激细胞。用Luminex测定24h培养上清液中的IFNG(n=2个重复/条件)。用1 mM CpG体外刺激幼稚胎鼠IL17rafl/fl和 Il17rafl/flxVillin cre+小鼠的(H和I)肝单个核细胞4h，再用brefeldin A刺激3h，然后用流式细胞仪进行分析。(H)典型的荧光激活细胞分选(FACS)图。(I)活IFNG+细胞、CD4+IFNG+细胞(设门于活CD90+TCRb+)和CD8+IFNG+细胞(设门于活CD90+ TCRb+)的数量(n=3-4只小鼠/组)。
4 肠道IL-17RA抑制肝脏和肠道IL-18
scRNA测序显示IL-18在Il17rafl/flx villin cre+肝脏中比例增加(图4A和4B)。IL-18与许多炎症状态有关，如巨噬细胞活化综合征，类风湿性关节炎和肝炎。研究选择进一步研究IL-18，因为它有能力提高IFNg的产量。在肝脏内，像CpG DNA这样的细菌产物已被证明可以激活靠近肝脏血管系统的细胞，如Kupffer cells (KCs)和肝星状细胞。事实上，对scRNA测序数据的分析表明，IL-18主要在KC、胆管细胞以及少量的非KC单核/巨噬细胞群中表达(图4A)。与scRNA测序数据一致的是，IL-18在肝脏中的转录物以及肝脏和血清中的蛋白质在幼稚的Il17rafl/flxVillin cre+小鼠中增加(图4C-4E)。研究者还观察到Il17rafl/flx Villin cre+小鼠小肠中IL-18的比例升高(图4F)，这表明除了局部来源外，肝脏IL-18的升高也可能通过门静脉循环来自肠道。此外，饮用水中的新霉素处理(耗尽革兰氏阴性菌)降低了血清IL-18，不仅为肠道参与提供了额外的支持，而且特别是微生物参与了IL-18的调节(图4G)。
为了评估CpG DNA是否在肝脏IL-18水平升高中起作用，用CpG DNA体外刺激肝脏单个核细胞。事实上，我们观察到CpG DNA刺激后IL-18的诱导(图4H)。此外，CpG诱导的IFNg在体外用抗IL-18处理后减少，表明CpG DNA以IL-18依赖的方式诱导肝脏IFNg (图4I)。IL-18是一种多效性细胞因子。除了诱导IFNG的能力外，它的一系列功能包括改变细胞激活分子、趋化因子的产生和Fasl的表达。Con A注射90分钟后，在Il17rafl/flx Villin cre+小鼠的肝脏中有激活、趋化因子表达和效应功能增加的标志(图4J)。
图4 肠道IL-17RA抑制肝脏和肠道IL-18. (A，B和J)静脉注射刀豆蛋白A(25 mg/kg)90分钟后，对富含单核细胞的IL17rafl/fl和 Il17rafl/flxVillin cre+肝细胞进行单细胞RNA测序(n=2只小鼠/组)。(A) IL17rafl/fl和 Il17rafl/flxVillin cre+肝脏数据集中Il18表达细胞的t-SNE根据相对表达水平着色。用于参考的细胞类型聚类的T-SNE(与图3A相同)。(B) IL17rafl/fl(” Neg”)和Il17rafl/flxVillin cre+ (“pos”)肝脏数据集中的Il18表达式(归一化，对数变换)的小提琴曲线图。(J) IL17rafl/fl(”Neg”)和Il17rafl/flxVillin cre+ (“pos”)肝脏单细胞RNA测序后90分钟的各种归一化、对数转换的基因表达水平的小提琴曲线图。测定初产仔鼠IL17rafl/fl和 Il17rafl/flxVillin cre+小鼠的(C-F)，肝脏IL18(C)，肝脏IL-18(D)，血清IL-18(E)，回肠末端IL18(F)。(G)小鼠自由饮用1g/L新霉素5d后测定血清IL-18水平。用CpG(1 MM)±抗IL-18(5 mg/mL)刺激幼稚野生型C57BL/6小鼠(H)或仔鼠IL17rafl/fl和 Il17rafl/flxVillin cre+小鼠(I)的肝细胞(H和I), ELISA法检测培养上清液中IL-18(H)和IFNG(I)的含量。
5 IL-18诱导的FasL加重肝脏炎症
在下游的IL-18靶标中，特别是Fas配体(FasL)与Con A肝炎密切相关，因为Fas或Fasl的敲除足以改善肝脏炎症疾病。在肝脏中，Fasl主要由T细胞、NK细胞和NKT细胞表达(图5A)。我们通过流式细胞观察到幼稚的Il17rafl/flxVillin cre+小鼠肝脏中FasL+细胞和FasL平均荧光强度增加(图5B-5D)。为了测试FasL在肝脏炎症恶化中的功能作用，研究者在Con A注射前1小时给小鼠注射FasL抗体。根据血清ALT和TUNEL染色，FasL抗体治疗改善了肠道特异性敲除小鼠的肝炎，其疾病严重程度与对照组相当(图5E-5G)。为了研究IL-18是否能诱导肝脏FasL，用IL-18联合IFNG抗体体外刺激肝脏单个核细胞，并用流式细胞进行分析(图5H和5I)。虽然天然基因敲除的反应与对照组之间没有显著差异，但结果显示IL-18以IFNG非依赖性的方式刺激TCR b+细胞产生FasL(图5H和5I)，这与IFNG阻断剂无法改善加剧的Con A型肝炎是一致的。
图5 IL-18诱导的FasL加重肝脏炎症. (A)在ConA 处理(25 mg/kg)后90分钟对IL17rafl/fl和 Il17rafl/flxVillin cre+小鼠肝细胞进行单细胞RNA测序(n=2只小鼠/组)。Fasl+细胞的t-SNE图。根据细胞类型的相对表达水平和参考t-SNE着色。(B-D)流式细胞术分析幼仔IL17rafl/fl和 Il17rafl/flxVillin cre+小鼠(n=7-11只/组)肝脏FasL+细胞。(B)绘制为IL17rafl/fl的折叠转换的FasL+活细胞数。(C)活FasL+细胞的FasL几何平均荧光强度(GMFI)。(D)FasL+细胞的代表性直方图。(E-G)野生型对照组和Il17rafl/flx Villin cre+小鼠(n=6-28只/组)静脉注射。FasL(250-500mg/只)抗体静脉注射前1小时刀豆蛋白A(25 mg/kg)。Con A后8h检测血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)(E)和TUNEL染色(F)。(G)TUNEL染色肝脏的代表图像，用50 ng/mL IL-18±5 mg/mLIFNG抗体外刺激幼稚仔鼠IL17rafl/fl和 Il17rafl/flxVillin cre+小鼠的肝脏单个核细胞(H和I)，并用流式细胞进行分析。TCR b+ FasL+细胞的百分比(H)和实际数量(I)(以活的CD90+细胞上设门)
6 抗IL-18抗体减轻肠道IL-17辐射小鼠的肝损伤
最后，为了评估Il17rafl/flx Villin cre+小鼠体内升高的IL-18是否导致肝病恶化，我们在注射conA前1天用抗IL-18抗体或同型对照治疗了Il17rafl/flx Villin cre+小鼠和窝仔对照组。抗IL-18治疗降低了Il17rafl/flx Villin cre+小鼠的肝炎水平，通过血清ALT检测，达到了与野生型小鼠相当的水平(图6A)。相应的肝脏病理显示肝实质细胞死亡面积减少(图6B和6C)。TUNEL染色的定量证实了Il17rafl/flx Villin cre+小鼠的细胞死亡大量减少到与窝虫对照相当的水平(图6B)。此外，通过qRT-PCR检测，抗IL-18治疗减少了在conA后8小时的Il17rafl/flx Villin cre+小鼠的肝脏IFNG和Fasl转录水平(图6D和6E)。
图6 抗IL18抗体减轻肠道IL17RA基因缺陷小鼠的肝损伤. IL17rafl/fl和 Il17rafl/flxVillin cre+小鼠在静脉注射刀豆蛋白A (ConA)(25 mg/kg)前1天用抗IL-18(0.5 mg/只)预处理，并于ConA后8h处死(n=7-9只小鼠/组)。(A)血清丙氨酸氨基转移酶(ALT). (B)TUNEL染色定量. (C)TUNEL染色肝组织学典型图像. (D和E)肝脏IFNG(D)和FasL(E)基因表达通过qRT-PCR检测.
结果
白细胞介素(Interleukin-17, IL-17) 影响肠上皮细胞的信号调节肠道菌群。基于已经报导的肠道生态失调、细菌易位和肝脏病变之间的联系，研究者假设肠道IL-17R信号在减轻肝脏炎症中起到关键作用。为了验证上述假设，研究者利用肠上皮特异性IL-17RA缺陷小鼠在免疫驱动的肝炎小鼠模型，发现这些小鼠出现微生物失调和细菌产物CpGDNA移位增加，从而推动了肝脏IL-18的产生，同时在疾病模型诱导时，肠内IL-17RA信号的缺失会加重肝炎和肝细胞死亡。IL-18是疾病恶化所必需的，并且与基于Ifng和Fasl表达的活化的肝脏淋巴细胞增加有关。因此，肠道IL-17R调节TLR9配体的移位并抑制对肝炎的易感性。上述结果将肠道Th17信号与肝炎中的菌群进行关联，对其他肠外病理中观察到的肠道免疫受损和随后微生物代谢产物释放具有更广泛的影响。
评论
辅助性T细胞17(Th17)在调节肠道微生物中起着关键作用。在肠道内，IL-17主要通过上皮细胞传递信号。相应地，上皮粘附细菌，如segmented filamentous bacteria (SFB)，也是由T细胞产生的IL-17诱导和控制的。Th17细胞通过多种机制调节肠道菌群，包括诱导抗菌肽(anti-microbial peptides, AMPs)、活性氧和免疫球蛋白A(IgA)。这些功能与其他Th17细胞因子共同作用，维持肠屏障的完整性和内稳态。越来越多的研究将肠道菌群的改变与肝脏的病变联系起来。例如，病毒性肝炎和自身免疫性肝炎的患者表现出肠道生态失调。在某些疾病的小鼠模型中，通过抗生素操纵微生物可以改善肝脏炎症。由于肝脏和肠道的血管系统密切相关，细菌的代谢产物通过门静脉排出肠道进入肝脏。事实上，许多肝脏炎症都与细菌移位增加有关，尽管有数据显示通过肝脏循环的细菌移位激活了Toll样受体(TLR)，目前我们还不完全清楚肠道内细菌/细菌代谢产物的移位如何影响局部肝脏免疫细胞。鉴于IL-17R在肠内稳态中的重要性，以及这些已报道的肝病与肠道生态失调和细菌/细菌产物易位之间的联系，肠道IL-17R信号可能在减轻肝脏炎症症状中起关键作用。
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