科研 | Nature子刊：16S rRNA分析哮喘儿童体内上呼吸道微生物群与哮喘控制能力丧失之间的关系
编译：小鹿同学，编辑：小菌菌、江舜尧。
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呼吸道微生物组在哮喘的病理生理中都具有重要作用。但是，关于哮喘儿童的呼吸道微生物组与哮喘控制丧失、哮喘重度恶化之间的关系，人们知之甚少。本文报道了微生物群的动态变化模式和组成与哮喘发作相关。研究者发现以Corynebacterium + Dolosigranulum为主要微生物群的受试者黄区时期发病率最低（p=0.005）。从随机分组时期到黄区时期呼吸道微生物群发生了改变。随机分组时期Corynebacterium + Dolosigranulum为主要微生物群的受试者在黄区时期微生物群转变为Moraxella为主，这也引起了重度哮喘急性发作的最高风险（p=0.04）。黄区时期Corynebacterium 的相对丰度与哮喘重度恶化呈反比（p=0.002）。
论文ID
原名：The upper-airway microbiota and loss of asthma control among asthmatic children
译名：哮喘儿童上呼吸道菌群与哮喘控制能力丧失
期刊：Nature communications
IF：11.878
发表时间：2019.12
通讯作者：Avraham Beigelman
作者单位：美国华盛顿大学圣路易斯儿童医院儿科
实验设计
结果
1 随机分组时期呼吸道微生物群的特征
首先，为了鉴定任何可以影响呼吸道微生物群的队列特征，研究者在随机分组时期（RD）从参加临床试验的214名儿童（平均年龄8.0±1.8岁，59%是男性，且57%是白种人）中收集的鼻腔刮拭样本进行了置换多元方差分析（PERMANOVA）。这214名儿童很好地代表了整个临床试验队列（n=254），因为参加该临床试验的254名儿童与这214名儿童的人口统计学数据和临床特征并没有统计学上的差异。
各个年龄组的总体微生物组成和丰度具有明显不同（p=0.02，PERMANOVA）。通过DESeq进行的差异丰度分析表明，年龄较大儿童（8~11岁）中Staphylococcus（p=0.04）的随机丰度较高，而年龄较小儿童（5~7岁）中Moraxella（p=0.05）和Streptococcus（p=0.03）的丰度较高（图1a）。与年龄较大的参与者相比，年龄较小的参与者（5~7岁）更容易出现黄区（YZ，即哮喘失去控制的早期迹象）（OR=3.2，95% CI 1.7-6.8，p=0.003）。房间内宠物的存在会增加YZ发生的风险（OR=2.8，95% CI 1.5-5.4，p=0.006；图1c）。22.9%的参与者在随机分组前6个月内接受了抗生素治疗，但这种随机变量并没有影响到随机分组时微生物群的组成（p=0.52，PERMANOVA）。除了年龄和宠物存在这些因素外，没有发现其它临床变量（性别、种族、BMI、总IgE水平、过去一年与哮喘相关的住院次数、外周酸性粒细胞的数目和肺功能值FEV1的百分比、FEV1/FVC）与YZ发生的风险相关。基于这些发现，所有后续分析（包括随机时期的样本）均根据年龄和家中宠物的存在进行了调整。
图1.随机分组时鉴定的前25种主要分类群。条形图显示了不同年龄组中前25个最丰富的分类群（a）和样本中存在的呼吸道病毒（b）。以95%置信区间来展示发展中YZ的比值（c）。原始数据通过源文件提供。
众所周知，病毒性呼吸道感染会加剧哮喘发作，因此研究者调查了研究队列中呼吸道病毒的影响。在随机分组时期的33%样本中检测到呼吸道病毒：其中64%是鼻病毒。较小的年龄组中病毒阳性样本的比例在数值上更高（年纪较小组：年纪较大组为39.3%：28.0%），但并不是显著不同（p=0.11，卡方检验）。与病毒阴性样本相比，病毒阳性样本中Moraxella（通过DESeq，p=0.04）的相对丰度较高，而Bacillus（通过DESeq，p=0.03）和Staphylococcus（通过DESeq，p=0.04）的相对丰度则显著较低，这表明病毒与这些细菌菌属之间可能存在相互作用（图1b）。然而，随机分组时期的样品中呼吸道病毒的出现（儿童并没有呼吸道症状）与未来YZ发生的风险（OR=1.4，95% CI 0.72-2.90，p=0.33）或未来哮喘发作的风险（OR=1，95% CI 0.39-2.44，p=0.9）无关。呼吸道病毒并不能在基线时预测随后的哮喘失控和发作，这一发现可能部分因为鼻病毒类型区分的缺乏，因为在儿童中，与鼻病毒A或B相比，鼻病毒C与哮喘发作最密切相关。尽管如此，所有随后的分析（包括随机时期的样本）都针对随机分组时期样本中呼吸道病毒的存在进行了调整。
2 基线时的微生物群和未来的哮喘失控
首先，为了评估哮喘得到良好控制时（随机分组时期）的微生物群是否与YZ时的哮喘失控相关，研究者对随机分组时的214个鼻样本进行了无监督的分层聚类分析。研究者确定了以下菌属占主导的四个簇：Corynebacterium + Dolosigranulum，Staphylococcus，Streptococcus和Moraxella（图2）。在随访期（320天）中，分别有75.7%和43.4%参与者分别经历了至少一次和两次的YZ发作。与其它3个簇、或任何其它簇的总和相比，随机分组时期的样本中拥有Corynebacterium + Dolosigranulum为主导簇的参与者的YZ发生中位数年变化率明显更低（图3a,b；p=0.005；秩和检验）。此外，Cox比例风险分析表明，与其它3个簇的参与者相比（图3c，p=0.03，ward test）及任何其它簇相比（图3d，p=0.05，ward test），Corynebacterium + Dolosigranulum簇中的参与者至少在两次YZ发生之间的时间明显更长。两组之间YZ首次发作的时间在统计学上并没有差异。
图2.随机分组时鼻样本中鉴定到的细菌簇（n=214）。通过层次聚类和完全连锁分析法鉴定到Corynebacterium + Dolosigranulum（蓝绿色），Staphylococcus（黑色），Streptococcus（粉红色）和Moraxella（蓝色）。相对丰度大于0.1%的细菌菌属用于聚类分析。对每个细菌簇进行了年龄分组、样品中出现呼吸道病毒和黄区发作年变化率的标注。原始数据通过源文件提供。
图3.随机分组时呼吸道细菌簇的黄区（YZ）年率。a.与其它3个簇的组合相比，Corynebacterium + Dolosigranulum簇的YZ年率。箱形图中间的线代表YZ年率的中值；箱形图底部和顶部的线分别代表数据值的25%和75%。垂直线上方的点代表数据中的异常值。b.四种呼吸道细菌簇的YZ年率。在图a，b中，每个点代表簇中的每一个参与者。使用秩和检验来检测两个簇之间YZ年率的统计学差异。c. Corynebacterium +Dolosigranulum簇与其它3个簇的组合相比，发展为YZ时期至少2次哮喘发作（通过Cox比例风险分析，p=0.02）的可能性显著减低。d. Corynebacterium +Dolosigranulum簇与Moraxella 簇、Staphylococcus簇相比，发展为YZ时期至少2次哮喘发作（通过Cox比例风险分析，p=0.05）的可能性显著降低。c，d图中细菌簇的颜色与a，b图中一致。原始数据通过源文件提供。
3 从随机分组时期到YZ时期呼吸道微生物群的变化
接着，研究者利用来自102位参与者的样本从随机分组时到YZ发作时的鼻微生物群的动态变化，这些参与者在随机分组和YZ时期均提供了样本（102对样本，总共204个样本）。个体患者的细菌组成及其相对丰度表现出从随机分组时到YZ时期的深刻变化（图4b，图5）。令人惊讶的是，超过一半的患者这两个时间点之间切换到了一个不同的优势簇群，最常见的是Streptococcus簇（图5）。结果，Streptococcus簇变成了YZ时期最普遍的簇（图4a）。微生物群的变化在细菌α多样性和细菌总数中也很明显。在YZ时期，总细菌数（图4c）和细菌富集度（图4d）显著高于随机分组时期的情况（两个均p<0.01，秩和检验）。
图4.随机分组时期（RD）和黄区时期（YZ）之间细菌微生物组的比较。a.使用成对的随机分组时期（n=102）和黄区（n=102）数据鉴定出5个细菌簇。每个条形图代表了属于给定细菌簇的患者比例。RD采集的样本为绿色，YZ采集的样本为橙色。绿色/橙色条形的比例总和等于100%。使用Chiseq-test确定5个簇中患者分布的统计学差异。b.每个研究参与者在RD到YZ过程中细菌微生物组的相对丰度变化。图中标绘了每一个受试者在RD（上图）到YZ（下图）过程中前25种细菌的相对丰度变化。样品按照RD的细菌簇排列，从左到右依次为（1）Corynebacterium + Dolosigranulum（2）Haemophilus（3）Moraxella（4）Staphylococcus（5）Streptococcus。c. RD和YZ样本中的总细菌数。通过qPCR估算总细菌数为每微升16S rRNA百万个拷贝。d. RD和YZ的细菌丰富度。使用秩和检验检测总细菌数和细菌丰富度的统计学差异。原始数据通过源文件提供。
图5.从随机分组时期到黄区时期细菌簇的变化。RD（左边）和YZ（右边）中每个细菌簇中的数字是每个特定簇转变的患者数目。原始数据通过源文件提供。
4 YZ时期和哮喘发作时的呼吸道菌群
为了检验YZ时期的微生物组是否与哮喘病情恶化有关，研究者比较了需要口服糖皮质激素（OCS）治疗的重度哮喘参与者（30/105=28.6%）和无需OCS治疗参与者（75/105=71.4%）之间的微生物群差异（图6）。研究者发现，YZ时期与其它3个簇相比，来自Corynebacterium + Dolosigranulum簇的需要OCS治疗的患者的比例在数字上要低，但在统计学上不具有统计意义（图7a，p=0.35，Chiseq-test）。此外，对特定细菌菌属的分析表明，YZ时期发作但未发展为重度哮喘患者中收集的样本中，Corynebacterium更为丰富（图7b，p=0.002，DESeq）。此外，Corynebacterium 相对丰度较高与病情恶化的风险有所降低相关（OR=0.92，95% CI 0.89-0.94，p=0.04）。这种效果不是很强的原因可能与受试者发展为重度哮喘的比率相对较低有关，从而导致YZ时期的分析效果降低。研究者没有发现随机分组时期与重度哮喘时期的微生物组之间有任何关联，这可能是因为RD和YZ之间的微生物组已经发生了深刻的变化。最终，黄色区域时期的细菌富集度（p=0.64，秩和检验）或总数（p=0.16，秩和检验）与重度哮喘发作时的情况无关。
图6.黄区时期（YZ）的105个鼻样本中鉴定的细菌簇。通过层次聚类和完全连锁分析法鉴定到Corynebacterium + Dolosigranulum（蓝绿色），Staphylococcus（黑色），Streptococcus（粉红色）和Moraxella（蓝色）。相对丰度大于0.1%的细菌菌属用于聚类分析。原始数据通过源文件提供。
图7.YZ时期的微生物组和哮喘重度恶化的治疗结果（OCS治疗）。a.在YZ的不同细菌簇分组中发展为哮喘重度恶化患者（OCS治疗，n=30）的比例。b.发展为哮喘重度恶化患者在YZ时期的Corynebacterium相对丰度显著降低（P=0.002，DESeq）。原始数据通过源文件提供。
5 微生物群的动态变化和哮喘加剧
考虑到大多数参与者的上呼吸道菌群从随机分组时期到YZ时期发生了改变（图5），研究者接着调查了微生物群的动态变化（即切换至不同簇或维持同一个簇不变）是否与哮喘加剧有关。与其它组合簇群的变化相比，随机分组时期Corynebacterium + Dolosigranulum簇转变为YZ时期的Moraxella簇，这种变化与哮喘加剧的高风险相关（P=0.04，Chiseq-test）。
6 YZ时期的呼吸道病毒和哮喘加剧
接着，研究者评估了YZ时期的呼吸道病毒对哮喘加剧的潜在影响。在YZ时期样本中有78份（74.3%）检测到了呼吸道病毒，其中48份样本呈现肠病毒/人鼻病毒（EV/RV）阳性。病毒的存在与哮喘加重没有关系，这可能是因为这些样品中的病毒检出率非常高，同时YZ时期只有极少数没有病毒的样本，所有这些因素导致分析效果降低。属于Moraxella簇的样本（n=4）及属于Haemophilus簇的样本（n=6）都呈现出病毒阳性（图8）。有趣的是，YZ时期Moraxella簇或Haemophilus簇占主导的微生物群的大多数样品都是从RD时期非Moraxella簇或Haemophilus簇的样品转变而来的（图5），这反映了YZ时期会出现Moraxella簇群或Haemophilus簇群。
图8. YZ中五个细菌簇内呼吸道病毒呈阳性或阴性的受试者比例。病毒阳性（红色，n=78）和病毒阴性（蓝色，n=27）的样本数量不成比例的分布在不同的细菌簇中。属于Moraxella簇或Haemophilus簇的受试者都呈现病毒阳性反应。原始数据通过源文件提供。
讨论
在这项前瞻性的纵向研究中，研究者表征了每日接受低剂量吸入型糖皮质激素（ICS）使哮喘得到很好控制的（随机分组时期）和哮喘失控的（YZ时期）学龄儿童的上呼吸道细菌菌群。研究者发现呼吸道微生物群的定殖模式与哮喘失控和哮喘加剧的风险之间存在差异关联。具体而言，与那些致病性较高细菌（尤其是Staphylococcus，Streptococcus和Moraxella）为主导的微生物群相比，在随机分组时期归类为Corynebacterium + Dolosigranulum为主导的儿童呼吸道微生物群与哮喘失控风险较低相关。此外，在YZ时期，Corynebacterium的相对丰度与YZ时期发展为重度哮喘的可能性呈反比。
评论
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