科研 | Cell子刊：微生物发酵产生的琥珀酸能够通过肠道糖异生途径改善葡萄糖稳态
本文由张萌萌编译，张萌萌、江舜尧编辑。
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肠道菌群的结构失调是许多慢性疾病，如肥胖、糖尿病、高血压、冠心病、心脑血管疾病和结肠癌等因饮食结构不当造成的代谢性疾病的直接诱因。增加膳食纤维的摄入能够有效增殖肠道中的有益菌、改善肠道菌群结构、保护肠屏障功能，对慢性疾病具有预防作用。膳食纤维在肠道共生菌的作用下会形成短链脂肪酸，然而微生物发酵也会合成大量的琥珀酸。本研究通过给小鼠饲喂高纤维日粮来探究肠道微生物发酵产琥珀酸对机体葡萄糖稳态的调控机制。本研究通过对小鼠饲喂补充FOSs或琥珀酸的高脂高糖日粮，以及对小鼠肠道定植产琥珀酸菌，进而探究琥珀酸对动物肠道葡萄糖稳态的影响及其作用机制，为琥珀酸在动物糖代谢过程的作用机制研究提供理论基础。
原名：Microbiota-Produced Succinate Improves Glucose Homeostasisvia Intestinal Gluconeogenesis
译名：微生物发酵产生的琥珀酸能够通过肠道糖异生途径改善葡萄糖稳态
期刊：Cell Metabolism
IF：18.164
发表时间：2016年
通信作者：Filipe De Vadder
通信作者单位：法国国家健康与医学研究院
1. 低聚果糖能够增加盲肠琥珀酸浓度并改变肠道菌群组成
饮食能够改变肠道菌群的组成，进而可能影响微生物代谢产物的生成。我们先前的研究表明在缺乏G6pc（1-葡萄糖-6-磷酸酶，肠粘膜中糖异生途径的关键酶）的小鼠中，FOSs饲喂并没有观察到相应代谢的改变。因此，我们向野生型（WT）小鼠和缺乏G6pc（I-G6pc_/_）小鼠饲喂补充低聚果糖（FOSs）的高脂/高糖（HF-HS）日粮，观察到两者盲肠中琥珀酸浓度都显著升高（图1A）。此外，我们在小鼠盲肠中测定的所有羧酸中，琥珀酸的相对增加量是最高的（图1B和图S1A-D），在门静脉血和腔静脉血中，琥珀酸的浓度无显著改变（图S1E-F）。这表明盲肠中的琥珀酸是在肠道内代谢合成的。
图1A: 补充FOS的HF-HS饮食的小鼠盲肠中的琥珀酸含量
图1B: 补充FOS的HF-HS饮食的小鼠盲肠中的总短链脂肪酸含量
图S1A: 补充FOS的HF-HS饮食的小鼠盲肠和血清中乙酸的含量
图S1B: 补充FOS的HF-HS饮食的小鼠盲肠和血清中丙酸的含量
图S1C: 补充FOS的HF-HS饮食的小鼠盲肠和血清中丁酸的含量
图S1D: 补充FOS的HF-HS饮食的小鼠盲肠和血清中乳酸的含量
图S1E: 补充FOS的HF-HS饮食小鼠腔静脉血清中琥珀酸的含量
图S1F: 补充FOS的HF-HS饮食小鼠门静脉血清中琥珀酸的含量
在我们以前的研究中，向WT和-G6pc_/_小鼠饲喂FOSs日粮后，两者的结肠菌群均发生了改变。本研究中，我们进而分析了小鼠盲肠菌群组成，与我们先前的研究结果一致，FOS饲喂剧烈地改变了盲肠菌群组成（图1D-E）。在盲肠菌群组成中，厚壁菌门和拟杆菌门占比80％以上（图1C），FOS饲喂后，盲肠菌群中厚壁菌门/拟杆菌门比率显著降低（图1D）。与FOS饲喂后盲肠中琥珀酸浓度增加相一致的是拟杆菌门的相对富集（图1E），拟杆菌门包含主要的产丙酸或产琥珀酸菌。此外，在所有拟杆菌中，我们发现FOS饲喂后类杆菌属相对丰度增加最大（图1E）。盲肠琥珀酸浓度与类杆菌属的相对丰度呈显著正相关（图1F），类杆菌属微生物在肠道中可以发酵合成琥珀酸和丙酸，其水平取决于肠道中营养物质的可利用性。值得注意的是，我们在盲肠中没有发现任何对应于普雷沃氏菌属（Prevotella）的序列，普雷沃氏菌属是拟杆菌门中重要的产琥珀酸菌，能够参与机体血糖调节。
图1C:补充FOS的HF-HS饮食小鼠盲肠中最重要的菌群丰度图。
图1D:补充FOS的HF-HS饮食小鼠盲肠中厚壁菌门/拟杆菌门的比率变化
图1E:补充FOS的HF-HS饮食小鼠盲肠中拟杆菌门属水平的菌群丰度图
图1F:补充FOS的HF-HS饮食小鼠盲肠中的拟杆菌丰度与琥珀酸含量的线性相关图
2. 琥珀酸依靠肠道糖异生IGN途径改善葡萄糖稳态
为了确定喂食琥珀酸是否能够促进与FOSs类似的有益作用，以及这些作用是否是通过诱导IGN途径产生的。我们向野生型（WT）小鼠和缺乏G6pc（I-G6pc_/_）小鼠饲喂补充琥珀酸的高脂/高糖（HF-HS）日粮。与没有添加琥珀酸的对照饮食的小鼠相比，补充琥珀酸显著改善了WT小鼠的葡萄糖和胰岛素耐受性，对I-G6pc_/_小鼠无显著影响（图2A-F）。因此，琥珀酸介导的对葡萄糖稳态调控的改善需要IGN存在。
图2A:补充琥珀酸的HF-HS饮食21天后的禁食16h的WT小鼠的糖耐量曲线
图2B:补充琥珀酸的HF-HS饮食21天后禁食16h的I-G6pc_/_小鼠的糖耐量曲线
图2C:补充琥珀酸的HF-HS饮食21天后禁食16h的小鼠糖耐量曲线下面积图
图2D:补充琥珀酸的HF-HS饮食25天后禁食6h的WT小鼠的胰岛素耐量检测
图2E:补充琥珀酸的HF-HS饮食25天后禁食6h的I-G6pc_/_小鼠的胰岛素耐量检测
图2F:补充琥珀酸的HF-HS饮食25天后禁食6h的小鼠糖耐量曲线下面积图
盲肠中丙酸或其他的短链脂肪酸（SCFAs）的水平并未发生改变，表明琥珀酸对IGN具有直接作用（图S2A-B）。盲肠中琥珀酸水平没有增加（图S2C），表明大多数膳食来源琥珀酸在进入盲肠前已经被吸收利用。总之，这些结果表明，IGN在与琥珀酸相关的葡萄糖稳态的改善中起到了因果作用。
图S2A: 补充琥珀酸的HF-HS饮食的小鼠盲肠中丙酸的含量
图S2B: 补充琥珀酸的HF-HS饮食的小鼠盲肠中总短链脂肪酸的含量
图S2C: 补充琥珀酸的HF-HS饮食的小鼠盲肠中琥珀酸的含量
有趣的是，这些葡萄糖代谢的改变仅与琥珀酸喂养的WT小鼠的体重增加抵抗有关（图2G-I）。然而，这种体重下降与食物摄入量减少无关（图2J），表明喂食琥珀酸能够增加了机体能量消耗，与先前的FOS和丙酸饲喂试验观察结果一致。
图2G: 补充琥珀酸的HF-HS饮食1周后小鼠体增重
图2H: 补充琥珀酸的HF-HS饮食2周后小鼠体增重
图2I: 补充琥珀酸的HF-HS饮食3周后小鼠体增重
图2J: 补充琥珀酸的HF-HS饮食2周内小鼠的平均采食量
3. 琥珀酸在肠道内转化为葡萄糖并降低肝脏葡萄糖生成
我们接下来对大鼠饲喂3周富含琥珀酸的日粮，并测定其肠道内葡萄糖的生成（IGP）。我们使用了稳态葡萄糖示踪剂输注和动脉门静脉葡萄糖差异测定相结合的方法，使我们能够量化IGP和总内源性葡萄糖生成（EGP）。输注[3-3H]葡萄糖示踪剂后，与颈动脉相比，门静脉中[3-3H]葡萄糖特异性活性显著降低了6％（图3A），表明未标记的（在肠道内新合成的）葡萄糖已经释放，IGP占总EGP的16％-17％（图3A）。我们进一步研究了从肠道释放的新合成的葡萄糖中是否可以检测到来自琥珀酸的碳。我们将大鼠禁食24小时，然后将含有[U-14C]示踪剂的琥珀酸盐溶液输注入颈静脉，门静脉血中[U-14C]葡萄糖特异性活性升高了4.9％（图3B）。这表明在肠道内琥珀酸能够有效转化为葡萄糖。我们先前的研究表明，在正常摄饮食条件下几乎检测不到IGP，因此可以推测本试验中肠道内葡萄糖大部分来自琥珀酸的转化。
图3A: 补充琥珀酸的HF-HS饮食3周的大鼠的内源性葡萄糖产生（EGP）
和肠道葡萄糖通量测定
图3B:禁食24h大鼠肠道葡萄糖合成中琥珀酸来源的[U14C]测定
此外，我们检测了小鼠（补充琥珀酸的HF-HS日粮饲喂的C57Bl/6小鼠）肠道内葡萄糖-6-磷酸酶（G6Pase）的活性。不同于其他的微生物发酵产物，如丙酸和丁酸，这些小鼠的小肠中琥珀酸对G6Pase活性无显著影响（图3C）。值得注意的是，G6Pase活性是以酶促反应的最大速度进行评估的，所以酶活性的变化仅取决于活性酶的量。这表明琥珀酸在肠中起到葡萄糖前体物的作用，对葡萄糖异生酶的量无影响。然而，由于膳食琥珀酸似乎没有进入盲肠（见上文），因此我们在空肠中进行相关基因表达分析。当通过膳食纤维发酵产生琥珀酸时，不能排除琥珀酸可能对远端肠中基因表达的影响。有趣的是，我们观察到WT小鼠中肝葡萄糖生成的能力显著降低。事实上，我们注意到在喂食琥珀酸的WT小鼠中肝脏G6Pase活性降低了25％（图3D）。与肝脏中葡萄糖-6-磷酸水解的降低一致，我们观察到在这些小鼠中的肝脏中，葡萄糖-6-磷酸和糖原含量显著增加（图3E-F）。在喂食琥珀酸的I-G6pc_/_小鼠中没有出现这种对肝葡萄糖生成的抑制作用，进一步强调了琥珀酸诱导的IGN和抑制肝葡萄糖生成之间的联系（图3E-F）。总之，这些数据证实了IGN在琥珀酸改善葡萄糖稳态过程中的关键作用。
图3C: 补充琥珀酸的HF-HS饮食对WT小鼠的空肠中G6Pase活性的影响
图3D: 补充琥珀酸的HF-HS饮食对WT小鼠的肝脏中G6Pase活性的影响
图3E: 补充琥珀酸的HF-HS饮食对小鼠肝脏中G6P含量的影响
图3F: 补充琥珀酸的HF-HS饮食对小鼠肝脏中糖原含量的影响
4. 在常规小鼠肠道中定植产琥珀酸菌Prevauxla copri能够增加盲肠琥珀酸含量并且抑制肝葡萄糖的生成
在以膳食纤维作为基础饮食的人群中，宏基因组学研究结果显示其肠道内普雷沃氏菌属的细菌丰度显著增加。此外，我们先前的研究表明，在P.copri定植的无菌的Swiss-Webster小鼠中，盲肠中琥珀酸的水平显著增加，其他羧酸水平无显著变化，并改善了葡萄糖耐受性，同时肝脏中糖原贮存增加。为了评估这种产琥珀酸菌是否可以通过琥珀酸和IGN发挥其代谢益处，我们使用P.copri活菌培养物经口灌饲的(CONV-R) C57Bl/6WT小鼠和I-G6pc_/_小鼠。P.copri增强了两种小鼠的葡萄糖耐受性（图S3A-B）和胰岛素分泌（图S3C-D）。这与肝脏中G6Pase活性降低有关（图S3E）。值得注意的是，与对照组相比，P. copri口服灌饲的CONV-R WT小鼠盲肠中琥珀酸水平显著增加，但门静脉血中琥珀酸水平并无改变（图S3G-H）。这表明琥珀酸可被肠粘膜利用，用于葡萄糖的合成。在P. copri定植的I-G6pc_/_小鼠中未观察到盲肠琥珀酸水平的增加。总之，这表明普雷沃氏菌Prevauxlacopri代谢合成的琥珀酸可作为IGN的底物，但P. copri在改善宿主糖代谢方面也具有其他的与琥珀酸无关的途径。
图S3A:P. copri口服灌饲7天后的WT小鼠禁食16h后的葡萄糖耐量检测曲线
图S3B: P. copri口服灌饲7天后的I-G6pc_/_小鼠禁食16h后的葡萄糖耐量检测曲线
图S3C: P. copri口服灌饲的WT小鼠的血清胰岛素含量
图S3D: P. copri口服灌饲的I-G6pc_/_小鼠的血清胰岛素含量
图S3E: P. copri口服灌饲对小鼠肝脏中G6Pase活性的影响
图S3F: P. copri口服灌饲对小鼠肝脏中糖原含量的影响
图S3G: P. copri口服灌饲对小鼠盲肠中琥珀酸含量的影响
图S3H: P. copri口服灌饲对小鼠门静脉血清中中琥珀酸含量的影响
本研究表明低聚果糖能够增加盲肠琥珀酸浓度并改变肠道菌群组成，琥珀酸为肠道糖异生（IGN）途径的底物，能够通过糖异生途径来改善机体内葡萄糖稳态。在常规小鼠肠道中定植产琥珀酸菌Prevauxla copri能够增加盲肠琥珀酸含量并且抑制肝葡萄糖的生成。
该研究试验目的明确，具有一定的创新性，初步揭示了微生物产琥珀酸在动物肠道葡萄糖稳态维持中的作用，对于人类糖尿病等慢性病的研究具有一定的借鉴意义。琥珀酸微生物发酵的代谢网络复杂，涉及众多酶催化反应，其在肠道糖异生途径中的具体作用机制还需进一步研究。