基因敲除细胞株技术介绍

基因敲除细胞系

在我们研究基因功能的时候，基因敲除（Knock out，KO）是实现基因loss of function的重要调控方式。相比于传统的基因干扰（RNAi）技术，基因敲除可完全消除目的基因的表达，最终使其蛋白完全不表达或功能彻底丧失，也让我们可以更好地观察细胞表型的变化。

但基因敲除细胞模型的构建过程较为繁琐，需要耗费很长的实验周期，而且对于经验不是很丰富的研究者，很容易出现做了三四个月却最终敲除效果不彻底的情况，导致研究进度受阻。

细胞敲除成功案例

项目名称：人HCT116细胞PSME3基因敲除（片段敲除）

1、gRNA设计：

gRNA位点1：ATACGCTACCTAACATGGCTGGG； gRNA位点2：CCAGCATGCAAAATACAATGGGG

2、引物合成及质粒构建：

3、细胞转染

首先确定最佳的电转参数，进而通过电转的方式将载体转染进细胞。

4、筛选单克隆细胞并培养

5、PCR及电泳鉴定：

鉴定策略的原理如下：

6、测序鉴定：

ATAAACAGAGGATTTAAGACTTTTGTTATGTTTTAGACGC-del；1809bp--AGTGGCTAATGCCT GTAATCC CACCACTTTGGGAGGCCAA

 

7、克隆状态：

细胞检测结果：无菌、无支原体

培养体系：McCoy's 5A+ 10% FBS + 500μg/mL Hygromycin；1:3传代