科研 | 美国西奈山伊坎医学院张泽岳教授：帕金森氏病多尺度转录网络和关键调控因子的概况（Nature子刊）
编译：冬日暖阳，编辑：十九、江舜尧。
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论文ID
原名：The landscape of multiscale transcriptomic networks and key regulators in Parkinson’s disease
译名：帕金森氏病多尺度转录组网络和关键调控因子的概况
期刊：Nature Communications
IF：11.878
发表时间：2019.11.20
通讯作者：张泽岳
通讯作者单位：美国西奈山伊坎医学院
DOI号：10.1038/s41467-019-13144-y
结果
1 建立PD的集成式多尺度网络生物学框架
通过使用帕金森氏病和人类黑质为关键词搜索基因表达综合数据库（GEO，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）数据库，从八项人类PD研究中收集了基因表达数据。病例和对照组之间的差异表达基因（DEGs）通过Meta分析鉴定，然后进行BH校正。在DEGs上进行了基因本体（GO）分析，以识别PD中失调的途径。通过Z分数转换将来自集合中所有PD样本的表达数据合并到全局PD表达数据集中，并对对照样本进行相同的处理。随后，分别对全局PD和对照数据集进行了多尺度嵌入式基因共表达网络分析（MEGENA），然后，通过其对PD 中DEG的富集和细胞类型特异性标记物来表征PD网络中共表达的基因模块。同时，研究构建了基于模块的贝叶斯调节网络（BN），以推断每个基因模块中各基因之间的调节关系。基于PD DEG的差异表达和相邻网路富集，进一步确定了排名靠前的模块中的关键网络中心基因的优先级，从而进行实验验证。在Meta分析中以5％FDR和标准均差（SMD> 0.5）对8个精选数据集进行了PD和对照组之间的946个DEG分析。为了检测确定的DEG是否与临床特征相关，试验进行了一项单独的Meta分析，通过排除GSE4903628来确定DEG，GSE4903628是唯一具有完整临床评估和足够数量相关样本的数据集。这项单独的分析产生了420个DEG以及1,633个与Braak得分相关的基因。随后试验重点Meta分析了八个数据集确定了946个DEG，用于下游分析。GO分析显示，下调的DEG富含突触功能和与代谢相关的GO描述，表明神经元活性特别是神经传递受到损害。在PD中，DEG的上调与脊髓发育和胚胎数字形态发生有关。这些DEG与先前在PD死后大脑中发表的Meta分析基本一致。
2 PD MEGENA模块显示细胞类型特异特征
使用MEGENA从全部PD数据集中识别出总共90个模块大小> 50的模块（图1a）。然后，根据这些模块与PD的相关性对这些模块进行排序（图1b），这些模块是根据上述DEG的富集计算得出的（图1c）。由于中枢神经系统（CNS）由多种类型的细胞组成，这些细胞对PD的发病机理和进程具有独特的贡献，因此试验使用六种主要脑细胞类型（包括神经元，星形胶质细胞，小胶质细胞，内皮细胞，少突胶质细胞前体细胞（OPC）和人脑产生的少突胶质细胞（图1d），M32和M6-M160/M165分支虽然未显示任何细胞类型特异性，但对于下调的PD DEGs却显著富集，并分别与电子转运链和复杂的代谢过程相关，这表明不同细胞类型之间共有疾病机制。另一方面，M16富含PD上调的DEG（图1c）和少突胶质细胞特异性标记物（图1d），表明少突胶质细胞在上皮中起重要作用疾病进展。为了更好地了解PD网络，试验研究了上游模块的底层网络拓扑结构，该神经模块特定神经元M4由947个基因组成，并富含下调的DEG（图1f）。由于MEGENA网络中的链接是无方向性的，并且代表基因共表达或共调控，因此试验使用来自PD患者的同一组基因表达谱进一步构建了基于模块的BN，以推断基因之间的潜在调控关系。
图1与PD相关的基因共表达
3 PD GWAS基因的网络特定功能注释
MEGENA网络中基因之间的联系表明，在相似的生物学过程中，高度相关且具有潜在的共调节作用。因此，相邻网络可用于注释已知PD风险基因的生物学功能。PD MEGENA网络包含在GWAS目录中精选的125个已知PD GWAS基因。对于每个GWAS基因，试验将在其两层相邻网络中富集的上游途径定义为假定注释。例如，AAK1被预测与突触信号传导有关，实际上据报道它可以调节网格蛋白介导的胞吞作用。PD GWAS基因的此类上下文注释可以应用于网络中的任何基因，从而了解其疾病特异性功能。此外，试验检查了每个PD GWAS基因的相邻网路如何丰富PD DEG的特征（图2a）。富集分析表明PD发病机制中有更多的基因参与，而与该疾病的遗传关联无关。PD相对于对照而言，PD中下调的基因最丰富的相邻网路和GWAS基因是INPP5F，GCH1和RIT2（图2b-d），GCH1和RIT2在PD中的显著下调。前两个GWAS基因分别是BAG3（图2e）和PDNF（图2f），后者在PD中上调，BAG3（图2e）在PD中上调。尽管STMN2不是PD的已知遗传危险因素，但试验的研究结果表明STMN2在功能上与某些PD危险基因相关，并可能在介导PD分子改变中起关键作用。
图2 PD GWAS基因排名靠前的子网
4 Stmn2敲除导致DA神经元的突触前功能障碍
众所周知，Stmn2可以调节发育过程中的微管动力学，轴突形成和神经突生长以及损伤后的再生，而试验预测Stmn2可以调节PD中的突触前活性。为了验证这一假设，试验在其中Stmn2高表达的中脑DA神经元中采用了pHluorin的活细胞成像分析，pHluorin是对pH敏感的绿色荧光蛋白（GFP）的变体，当靶向突触小泡呈酸性腔时pHluorin会被淬灭，但当暴露于细胞外缓冲液（pH 7.4）时，胞吐作用会发出荧光。将pHluorin与水泡转运蛋白结合使用以定量的方式检查突触囊泡动力学。Stmn2-shRNA转染后9-11天记录了表达CMV-vMAT2-pHluorin的DA神经元，与shRNA处理的DA神经元相比Stmn2-shRNA处理的DA神经元在刺激后和刺激过程中均显示出SV内吞作用受损（图3a，c），而胞吐作用并未受到明显影响（图3a，b），试验还观察到pHluorin分析的Stmn2敲除DA神经元增大（图3d，e），而在记录时未见明显的躯体变性或细胞死亡。有趣的是，在培养的TH阴性神经元中大小没有显著影响（补充图5d，e）。因此，数据证实了基于网络的预测，并指出了STMN2在调节突触前活动中的关键作用。
5 Stmn2敲除干扰以STMN2为中心的子网
DEG分析鉴定了由Stmn2敲除引起的527个上调基因和115个下调基因（倍数变化≥1.2，FDR≤0.05；图4a）。Stmn2本身下调程度最高，表明其敲除效率。然后，试验检查了Stmn2敲除是如何影响PD患者STMN2相关基因的。在将小鼠基因比对到人类同源序列后，试验发现PD患者中和STMN2正相关的基因与Stmn2基因敲除小鼠中下调的基因重叠。PD患者中的STMN2和Stmn2基因敲除小鼠中的基因上调（图4b，c），由于Stmn2敲除小鼠中的大多数DEGs均被上调并参与了免疫反应，而死后PD大脑的数据集的Meta分析中没有这种免疫反应，因此试验认为该Stmn2敲除小鼠模型可能部分概括了人类大脑中PD的致病过程。
6 敲除Stmn2损害小鼠的运动功能
接下来，试验检查了敲除Stmn2是否可以诱导PD样的行为和病理变化。试验2个月大的雄性小鼠的SN中单月注射带有靶向shRNA Stmn2。试验在注射后的第四个星期通过进行Rota-rod和露天试验来评估运动能力（图5a）。注射Stmn2-shRNA的小鼠在杆上花费的时间明显少于使用加扰的shRNA注射的小鼠（图5b）。在开阔地带，用Stmn2-shRNA处理的小鼠显示的垂直发作次数少于加扰的shRNA处理的小鼠（图5c），但而两组之间的总距离没有差异（图5c，d），并且在Stmn2敲除小鼠中出现了向较短中心移动的趋势（图5e）。由于注射剂是单侧注射给小鼠的，因此苯丙胺的注射可引起小鼠旋转不对称，这通常用于测试运动功能性病变中DA依赖的进展。苯丙胺治疗确实在Stmn2敲除小鼠中引起了对侧旋转的显著增加（图5f）。因此，本试验数据表明Stmn2敲除导致了DA相关的运动功能障碍。
7 Stmn2敲除可减少纹状体DA含量
试验通过高效液相色谱（HPLC）进一步检查了纹状体DA含量。试验发现与注射Stmn2 shRNA的小鼠的对侧（左侧）相比，同侧（右侧）纹状体的DA以及三种主要代谢物（DOPAC，3-MT和HVA）降低了50％（图6a）。试验还根据DAT荧光强度检查了背侧和腹侧纹状体中多巴胺转运蛋白密度。与加扰的shRNA注射的小鼠相比，与加扰的shRNA注射的小鼠相比，同侧的小鼠背侧和腹侧纹状体的DAT +末端密度均降低（图6b，c），表明Stmn2导致的敲除SN和腹侧被盖区（VTA）中DA神经元的终末变性。通过AAV RFP标签定位，试验确认了病毒扩散到SN邻近的大脑区域。
8 Stmn2敲除导致DA神经元丢失
然后，试验通过在注射的小鼠中对黑质致密部（SNc）和VTA的TH+神经元进行立体统计，来确定运动能力减弱和纹状体DA含量降低是否与DA神经元的丢失有关。试验发现，与加扰的shRNA注射的小鼠相比，注射Stmn2-shRNA的小鼠的SNc中TH+神经元显著减少（图7a，b），还观察到VTA中的TH+神经元减少了40％（图7c）。在注射Stmn2-shRNA的中脑中发现裂解的caspase-3免疫染色增加（图7d），这证实TH+细胞数量的减少可能是由于凋亡性细胞死亡所致。试验还检查了黑质网状组织（SNr）中的TH-/NeuN +神经元，发现该区域没有明显的细胞丢失（图7e，f），表明当Stmn2耗尽时，TH+神经元特别脆弱。
结论
遗传和基因组学研究提高了试验对遗传性帕金森氏病（PD）的了解，但是特发性PD的病因和病理生理学仍不清楚。本研究通过采用多维度网络生物学方法描绘黑质中的基因-基因调控结构，并确定PD转录组网络的关键调控因子，对8个PD死后脑转录组研究进行了Meta分析。确定STMN2编码的stathmin家族蛋白在PD脑中下调表达，为功能上与已知PD风险基因相关的关键调控因子。网络分析预测了人类STMN2在突触运输中的功能，并在Stmn2敲除小鼠多巴胺能神经元中得到了验证。小鼠中脑的Stmn2减少导致多巴胺能神经元变性、磷酸化α-突触核蛋白升高以及运动功能障碍。本研究的综合分析不仅可阐明PD转录组学网络的全球格局，而且查明了PD致病途径的潜在关键调控因子。
评论
总而言之，本试验综合网络生物学方法已系统地发现了许多基因子网和PD的关键调控因子。然而，当前研究仅提供了对死后PD大脑的大部分DA神经元退化的数据，这种局限性直接构成了重建疾病进展的分子过程的障碍。临床评估的不完整和已发表研究的样本数量有限，也使试验无法对分子数据与临床和病理生理特征进行严格的关联研究。试验希望通过全面的纵向研究，增加样本量以及更好地诊断PD来改善本试验方法。尽管如此，本试验研究提供了证明综合系统方法治疗复杂疾病的原理。当务之急是，未来的研究应从具有高质量表观遗传学、转录组学和蛋白质组学数据中发展出一个大型且连贯的多组学研究数据，这最终将使发现更强大的特发性PD调节剂成为可能。
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