科研 | 浙江大学：转录组分析证明Dusp1是小鼠暴露于粉煤灰颗粒后炎症反应的关键调节因子（国人作品）
编译：冬日暖阳，编辑：十九、江舜尧。
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环境中的粉煤灰是PM2.5的主要成分之一，会导致各种呼吸道和心血管疾病。长期暴露于细颗粒空气污染是肺癌的主要危险因素之一。粉煤灰包含各种有毒重金属和有害有机分子，例如多环芳烃，醌和羰基化合物，能够进入呼吸道，并通过肺和全身循环到达全身诱导氧化应激和炎症反应。
丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)信号通路涉及多种细胞功能，包括应激反应以及细胞增殖和分化。各种各样的细胞外刺激诱导MAPKs的磷酸化和激活。在免疫细胞中，这些刺激通常包括细胞因子，趋化因子，活性氧，抗原抗体复合物以及与toll样受体结合的病原体相关分子。MAPK是通过保守的TXY序列内的苏氨酸和酪氨酸残基的磷酸化激活的丝氨酸/苏氨酸激酶。MAPK途径级联的三个主要臂是ERK(细胞外信号调节激酶)，JNK(c-JunN端激酶)和p38。它们介导免疫细胞对各种刺激的功能反应。众所周知，MAPK在促进呼吸道疾病的促炎性发病机理和疾病进展中起着重要的作用, MAPK去磷酸化可以由丝氨酸/苏氨酸磷酸酶，酪氨酸磷酸酶和/或双特异性磷酸酶介导。双特异性磷酸酶1(Dusp1)，也称为MAPK磷酸酶1，是核有丝分裂原和应激诱导型MAPK磷酸酶。Dusp1内源性地通过去磷酸化抑制MAPK信号传导途径。它通过控制气道细胞中促炎性MAPK信号传导的程度和持续时间，起到负反馈效应的关键作用。此外，糖皮质激素是用于慢性呼吸道疾病(包括哮喘和慢性阻塞性肺疾病)的一线抗炎药，通常在治疗上用作吸入性糖皮质激素。 Dusp1基因的启动子区域含有糖皮质激素受体的结合位点。糖皮质激素在启动子水平上增加Dusp1的表达，并减弱其蛋白酶体降解。在多种体外，离体和体内呼吸道疾病研究中，Dusp1已被证明有助于糖皮质激素的作用。最近，报道了Dusp1通过稳定核因子红系2相关因子2(一种调节氧化反应的主转录因子)来促进细胞防御系统。尽管Dusp1在调节炎症和氧化信号中起关键作用，但其在粉尘暴露的肺部反应中的功能仍然难以捉摸。当前使用从中国城市垃圾焚化炉(MWI)收集的粉煤灰颗粒进行的研究，对与野生型(WT)相比，Dusp1−/−小鼠肺部接触粉煤灰颗粒的信号网络具有广泛性。
论文ID
原名：Comparative transcriptome analysis reveals Dusp1 as a critical regulator of inflammatory response to fly ash particleexposure in mouse
译名：转录组分析证明Dusp1是小鼠暴露于粉煤灰颗粒后炎症反应的关键调节因子
期刊：Ecotoxicology and Environmental Safety
发表时间：2020.1.6
影响因子：4.527
通讯作者：王秀军
通讯作者单位：浙江大学医学院
DOI号：10.1016/j.ecoenv.2019.110116
实验设计
野生型(WT)BALB/c小鼠和C57BL/6背景的Dusp1−/−小鼠用于试验处理。将小鼠关在微型隔离笼中，该笼子在从07:00至19:00(12/12-h光照/黑暗周期)照亮的房间内，允许随意取水和食物。通过将C57BL/6背景Dusp1−/−小鼠与BALB/c WT小鼠进行8次回交产生了BALB/c背景Dusp1−/−小鼠。将六周大的雄性BALB/c背景小鼠随机分为两个治疗组，F3-S组和媒介物组。F3-S组鼻内给予F3-S溶液，每日20 mg/kg体重，连续3天。F3–S组的PM2.5剂量与其他体内暴露报告的剂量相当。在鼻内施用飞灰颗粒之前，通过单次注射4％水合氯醛麻醉小鼠，并监测麻醉深度。麻醉后，将小鼠置于仰卧位，并用微量移液器将悬浮颗粒滴入每个鼻孔。将等量的盐水给予媒介物组。吸出液体后，使小鼠在视觉观察下恢复。最后一次给药后六小时，通过颈脱位法处死小鼠。通过眼眶后出血收集血液。提取其RNA样本，并进行转录组测序分析。
结果
1 颗粒的表征
本研究中使用的F3粉煤灰是从中国城市垃圾焚化炉(MWI)的袋式除尘器收集的。 F3包含重金属铝(17.7 mg/g)，铁(12.5 mg/g)，锌(4.1 mg/g)，铜(1.7 mg/g)，锰(0.8 mg/g)，铅(0.7 mg/g)，铬(0.3 mg/g)，镉(<0.1 mg/g)和砷(<0.1 mg/g)。透射电子显微镜显示可溶性粉煤灰颗粒(F3-S)处于超细和细小的尺寸范围内(图1A)。
2 Dusp1−/−小鼠更易受F3-S粉煤灰颗粒诱导的炎症
WT和Dusp1−/−小鼠暴露于F3–S(20 mg/kg BW)3天后，与生理盐水攻击的小鼠的正常气道相比(图1B)，间质淋巴细胞的轻度两种基因型在肺中的浸润。 WT小鼠血清中仅检测到40 pg/mL IL-6，而Dusp1−/−小鼠的IL-6升高至665 pg/mL(图1C)，表明F3–S触发了更强的炎症反应飞灰颗粒在Dusp1−/−小鼠中。
3. 盐水攻击的Dusp1−/−与盐水攻击的WT小鼠肺的DEGs
为了了解Dusp1缺乏症的结果，作者对盐水攻击的Dusp1−/−小鼠肺进行了转录分析。当作者将盐水攻击的WT小鼠与Dusp1−/−小鼠进行比较时，差异表达了756个基因，其倍数变化>1.5和p<0.05(图2)。在756个DEG中，上调431个，下调325个。使用WebGestalt工具对DEG进行功能注释分析(P<0.05; GO和KEGG途径分析)。
图2.盐水处理的Dusp1−/−与WT肺的RNA-Seq分析。
在GO生物学过程类别下，DEGs显着富集于10个过程(P<0.05)：防御反应，炎症反应，免疫反应，嗜中性粒细胞趋化性，嗜中性粒细胞迁移，多细胞生物过程的正调控，防御反应的调控，离子运输，粒细胞迁移以及对外部刺激的反应调节(图3A)。重要的是，在大多数GO_BP中，报道了许多对免疫和细胞防御系统有反应的基因。例如，最高的GO_BP防御反应中包含72个在细胞防御外部刺激中起关键作用的基因，表明细胞防御机制受到小鼠肺中Dusp1缺陷的损害。有趣的是，DEGs还富含10种KEGG途径：细胞因子-细胞因子受体相互作用，IL-17信号途径，炎症性肠病，NOD样受体信号途径，同种异体移植排斥，移植物抗宿主病，扩张型心肌病，I型糖尿病分子，细胞粘附分子和趋化因子信号通路(图3B)。值得注意的是，在所有KEGG途径中，大多数与免疫系统功能有关。
图3.盐水处理的Dusp1−/−与WT小鼠肺中DEG的GO生物学过程的富集率和KEGG途径分析。
4. F3–S处理的Dusp1−/−与F3–S处理的野生型小鼠肺的DEGs
为了确定粉煤灰在Dusp1−/−小鼠肺中的特定作用，在F3-S处理的Dusp1−/−和WT小鼠肺中进行了高通量RNA-Seq分析。在所有倍数变化>1.5和p<0.05的DEG(487)中(图4)，上调了352个，下调了135个。进一步的GO分析表明，Dusp1−/−小鼠暴露于F3-S与以下生物学过程有关：防御反应，炎症反应，免疫反应，中性粒细胞迁移，肽酶活性的负调节，中性粒细胞趋化性，急性期反应，内肽酶活性，细胞杀伤和对其他生物的反应的负调控(图5)。这些结果与盐水攻击的Dusp1−/−与盐水攻击的WT小鼠肺的转录组结果一致。 KEGG对DEGs的富集分析表明，它们与以下因素有关：细胞因子-细胞因子受体相互作用，IL-17信号通路，移植物抗宿主病，I型糖尿病，同种异体移植排斥和趋化因子信号通路(图5)。此外，KEGG对F3–S处理的Dusp1−/−和F3–S处理的野生型肺的富集分析表明，DEGs还包括：与单纯疱疹感染，人类巨细胞病毒感染，疟疾相关的基因病毒感染。我们的RNA-Seq结果突显了生理盐水和F3–S处理的数据集之间基因表达变化的相似性。综上所述，我们从这些结果中得出的发现强烈表明，无论是否暴露于飞灰颗粒Dusp1在肺部免疫反应中都起着重要作用。
图4. F3–S处理的Dusp1−/−与F3–S处理的WT小鼠肺的RNA-Seq分析。
图5. F3–S处理的Dusp1−/−与F3–S处理的WT小鼠肺中DEG的GO生物学过程和KEGG途径分析。
5 通过qRT-PCR确认RNA-Seq数据
通过qRT-PCR证实了前8个基因(Ccl12，Ccl19，Ccr1，Ccr5，Cxcl5，Il17f，Il6和Osm)的相对上调/下调(表1)。 qRT-PCR的结果与RNA-Seq的结果一致，证明了本研究中RNA-Seq数据的可靠性。
表1. qRT-PCR证实基因表达
讨论
使用高通量RNA-Seq分析转录组可提供对受环境污染物影响的一组基因和途径的广泛理解。先前的研究已证明Dusp1在气道疾病的抗炎活性中起主要作用，并通过控制头颈部鳞状细胞癌的炎症来起到抑癌作用。尽管Dusp1具有抗炎作用，但尚未完全阐明环境污染物对Dusp1功能的影响。据我们所知，我们首次对两个单独的数据集进行了差异基因表达分析：盐水处理的Dusp1−/−与盐水处理的WT；和粉煤灰处理的Dusp1−/−与粉煤灰处理的WT小鼠肺相比。通过这种方式，研究确定了Dusp1−/−小鼠肺中受主要环境污染物飞灰影响的全局和特定基因。研究在盐水处理的Dusp1−/−与盐水处理的WT肺中鉴定了756个DEG，在粉煤灰处理的Dusp1−/−与粉煤灰处理的WT肺中鉴定了487 个DEG。功能注释分析(GO和KEGG)表明，在两个数据集中，DEG都参与了抗炎功能。重要的是，KEGG通路细胞因子与细胞因子受体的相互作用在两个数据集中均显着丰富，而Dusp1缺乏症的影响导致两个数据集中几个细胞因子基因表达的上调。这些结果表明，Dusp1介导了抗粉煤灰暴露的抗炎作用。特别地，有关Dusp1缺乏症的主要数据集本身表明Dusp1−/−小鼠更容易发炎。基于Dusp1在抑制MAPK信号传导和促进Nrf2信号传导途径中的关键作用，作者假设由粉煤灰颗粒触发的Dusp1缺陷小鼠的异常炎症反应很可能是由于MAPK和氧化信号传导途径的失调所致。正在进行进一步的研究以调查潜在的机制。尽管现代焚化炉的化学排放受到限制，但焚化炉会产生飞灰并向大气中释放大量有毒化学物质。生活在焚化炉附近的人群可能会通过吸入被污染的空气接触化学物质。人们还可能在职业上接触焚化炉排放的化学物质。几项流行病学和实验研究表明，焚烧炉排放物与多种癌症的风险增加相关，包括肺癌和喉癌，白血病，淋巴瘤，软组织肉瘤以及其他对健康的影响。但是，MWI粉煤灰暴露引起的机制，生物标志物或作用仍然难以捉摸。这项研究使用小鼠模型揭示了与MWI粉煤灰颗粒短期暴露有关的关键肺信号网络。
总之，研究确定了Dusp1是粉煤灰暴露的炎症反应的关键调节剂，并表明它对于肺部的抗炎活性是必不可少的。我们的研究表明Dusp1是与PM2.5暴露相关的炎性呼吸道疾病的潜在治疗靶标。
评论
暴露于室外的细颗粒物(PM2.5)浓度是全球主要的健康问题。垃圾焚烧排放引起环境中PM2.5浓度的升高。呼吸道炎症是吸入PM2.5引起的主要特征。但是，分子机理尚未完全了解。双重特异性磷酸酶1(Dusp1)在调节气道炎症中起重要作用。在这项研究中，连续三天每天通过鼻内给药从中国城市垃圾焚化炉收集的粉煤灰颗粒(20 mg/kg体重)被送给BALB/c野生型(WT)和Dusp1−/−小鼠。尽管这些颗粒物在两种基因型中均引起了轻度炎症，但是在用粉煤灰颗粒攻击的Dusp1−/−小鼠中测得的血清白细胞介素6(665 pg/mL)的水平明显高于其WT对应物。通过RNA测序在两种基因型中进行了响应于暴露的肺编码基因的全转录谱分析。在粉煤处理下的Dusp1−/−小鼠与野生型WT小鼠中鉴定了487个差异表达基因(DEG)，其log2倍变化>1.5，p<0.05。对暴露于煤粉颗粒的Dusp1−/−小鼠特异的DEG的功能富集和分子途径作图，结果显示前10个受干扰的分子途径与免疫反应有关。研究表明，Dusp1在保护肺部免受粉煤灰侵害方面具有抗炎作用，表明Dusp1可能是治疗PM2.5诱发的呼吸道疾病的治疗靶标。
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