编译：夕夕，编辑：十九、江舜尧。
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导读
空间分辨转录组学的最新进展极大地扩展了复杂的多细胞生物系统的知识。近年来，该领域迅速扩展，并且已经开发了几种旨在将基因表达数据与空间信息相结合的新技术。尽管该领域正在快速发展，但仍然存在许多挑战需要解决，包括敏感性，组织类型依赖性以及获得详细单细胞信息的能力有限。。目前，没有任何一种方法可以解决所有问题。本文中，主要描述了空间转录组学方法，并讨论了它们的应用以及它们的优缺点。探索未来的发展，并探讨该领域的发展方向。原名：Spatially Resolved Transcriptomes—Next Generation Tools for Tissue Exploration
译名：空间分辨转录组-用于组织探索的下一代工具
期刊：BioEssays（2区）
IF: 4.396
发表时间：2020.3
通讯作者：Joakim Lundeberg
通讯作者单位: 瑞典KTH皇家理工学院工程科学学院化学生物技术和卫生部基因技术科学生命实验室
DOI号： 10.1002/bies.201900221
在生物学中，空间概念具有重要意义因为它可以让我们描述交互式生物网络，每个元素都受到周围环境的影响。例如，只有知道多细胞生物的物理位置后，才能完全理解它们的分子特性。原因是不同组织微环境中的细胞表达特定的基因集，因为它们都受到周围细胞的影响，并对其周围的细胞产生影响。例如，肿瘤微环境，其中几个构成肿瘤的癌细胞亚群在两个结构特征方面可能完全不同。如果我们进一步缩小到单个细胞的细胞壁内的微环境，空间概念就变得同样重要，因为细胞内功能和信号传递需要细胞内精确的位置参数。 沿着这条线，RNA分子的亚细胞位置可以推断出有关转录信息及其实际生物学意义的重要信息。目前尚未得到空间组织的重要性和分子的确切位置的信息，这推动了空间分辨转录组学的技术进步。本文，作者总结了可用空间技术的概况，并将不同的方法分为五个类别：基于微观基因表达技术；原位杂交技术；原位测序技术；原位捕获技术和空间数据重构。图1显示了本文提到的方法的简要时间表，表1列出了各个方法的特征。
捕获空间基因表达信息的方法是从样品中分离出目标区域。然后可以将这些区域分别放置在试管中，以进行RNA提取和随后的基因表达谱分析。进行亚型分析等，但覆盖较大的区域通常很麻烦，并且在整个组织中获取整体图像通常是不可行的。整个技术流程见图2。
激光捕获显微切割（LCM）是一种技术，使用激光束切除在显微镜下识别出的组织区域。在2017年，对LCM技术进行了优化，称为Geo-seq。将LCM与单细胞RNA测序结合，以分析小至10个单细胞的组织区域。尽管LCM是一项强大的技术，但该技术的工作量很高，这限制了要分析的样本通量。将组织样本切成薄薄的冷冻切片也可以分析区域化基因表达数据。2013年，将该方法应用于果蝇胚胎，在果蝇胚胎中沿前后体轴进行了冷冻切片和测序，揭示了已知和新发现的空间基因表达模式。RNA断层扫描避免了对RNA载体的需要。有研究人员冷冻切片了三个相同的斑马鱼胚胎，每个都沿着前后，腹背和左右进行切割。然后通过重叠来自所有冷冻切片的转录组测序信息以重构胚胎的3D转录图谱。与早期的冷冻切片方法相比，此方法在RNA定量和动检分辨率方面都更加出色。目前，RNA断层扫描无法应用于临床样品。体内转录组分析（TIVA）可用于分析活细胞。在TIVA流程中，完整的活组织切片首先要暴露于TIVA tags。这些tags附着在可穿透细胞的肽上，使它们能够进入细胞溶质。接着，通过激光激活选择感兴趣的细胞，然后激活TIVA tags并与细胞内的mRNA杂交。然后从选定的细胞中提取mRNA进行转录组测序并分析。但TIVA的局限性是通量较低，一次智能分析几个细胞。在细胞微环境中分析生态位的另一种方法是ProximID。由于大多数空间转录组学技术都专注于细胞是否紧密靠近，因此ProximID通过观察细胞之间的实际物理相互作用将其进一步发展。首先在温和的条件下将组织解离，从而保留包含两到三个细胞的小相互作用结构。 然后，手动显微切割相互作用的细胞结构，并对单个细胞进行scRNA-seq处理。 然而，手动显微解剖的工作量较大，因此在通量方面受到限制。ISH技术自1960年代就已经存在，并且从1980年代初开始一直用于可视化基因表达。荧光标记的探针分别与预定的RNA杂交，以可视化固定组织中的基因表达。荧光原位杂交（FISH）的进一步发展反而利用了多个较短的探针，它们可以靶向同一转录本的不同区域。这种称为单分子RNA荧光原位杂交（smFISH）的方法可提供更高且更稳定的信号，可以对转录本进行定量测量。最初，一组五个探针（50 bp）分别与五个荧光团偶联，用于靶向每个转录本。但是，由于杂交特性的改变以及合成和纯化的复杂性，具有大量荧光团的标记探针具有挑战性。但是，由于杂交特性的改变和自猝灭以及合成和纯化的复杂性，具有大量荧光团的标记探针具有挑战性。尽管smFISH具有高灵敏度和亚细胞空间分辨率，但是由于光谱的固有局限性，它一次只能定位几个基因。2014年开发了基于顺序杂交的多重smFISH方法。通过一系列连续的杂交，成像和探针剥离检测转录本。在每次杂交过程中，为每个靶标使用24个编码探针。但是，杂交次数的增加需要增加探针数量。基于FISH的方法的一个普遍问题是组织样品类型。2011年，Advanced Cell Diagnostics推出了商用RNAscope分析仪。该方法的核心是探针设计，其中两个相邻的“ Z探针”与靶RNA转录物结合，形成随后的扩增子分子杂交所需的结合位点。信号放大所需的杂交级联反应遵循分子分析中通常采用的逐步结合的概念，以增加信噪比。在2019年7月，同时检测到的RNA靶标的最大数量增加到12个。低多重RNAscope也已与成像质量细胞术（IMC）结合使用，其中DNA树与金属标签杂交。到目前为止，已经证明了该方法可用于较少数量的同时mRNA和蛋白质靶标，并且所提出的方案化学方法可确保进一步评估表位检测的最终极限。在2019年，提出了一种称为“ DNA显微镜”的无光学核苷酸定位图，该图不依赖于已知位置的物理捕获，而是依赖于热力学熵。对于标准设备，传感器定位理论采用了位置重建方法。UMI构建体在随后的一轮随机核苷酸插入中链接在一起，从而产生“唯一事件标识符”（UEIs）。该概念的核心是目标原始源之间的物理距离将反映UEI形成的可能性。 对连接体进行DNA测序后，该流行度将用于推断不同靶标之间的邻近性，因此可以创建图像以及有关靶标的单核苷酸信息。迄今为止，该技术仅在培养细胞中仅对少部分转录本进行了证明。2013年发布了第一个基于原位测序的方法，该方法使用挂锁探针靶向已知基因。在完整的组织切片中，mRNA首先被反转录为cDNA，挂锁探针可以与cDNA结合。挂锁探针是包含与靶标cDNA区域互补的单链DNA。该方法有两种选择，一种是挂锁探针与cDNA靶标结合，两端之间有一个缝隙，另一种是两端彼此相邻。在第一种情况下，通过DNA聚合来填补缺口。然后在两种情况下，都会将末端连接起来形成一个DNA环。目标扩增是通过称为滚环扩增（RCA）的过程进行的，从而产生了微米级的RCA产物（RCP），其中包含许多挂锁探针序列的重复序列。然后，对RCP进行连接测序（SBL）。无间隙方法显示出更高的灵敏度，而间隙填充方法可以读取转录本的序列，其中间隙的可变长度可达4bp。通过将ISS应用于乳腺癌组织切片，可以对31个靶标进行空间定位。与基于杂交的技术相比，此方法具有检测SNV的能力。CARTANA公司于2017年成立，主要用于提供样本预处理试剂盒和服务。2019年，ISS分析可以在微流体平台上实现自动化，可以显著降低整个流程的运行时间。ISS最近开发的另一种方法是空间解析的转录本扩增比对（STARmap）。STARmap使用带条形码的挂锁探针，该探针与靶标杂交。可通过添加第二个引物来避免逆转录。该方法避免了cDNA转换的效率低，并通过添加第二个杂交步骤降低了噪音。然后通过RCA扩增该构建体，以生成称为纳米球的纳米级单链DNA产物。随后清除组织-水凝胶复合物的未结合蛋白和脂质，从而增强组织的透明度。 接下来，采用改进的SBL方法解码5bp的barcode。通过结合使用水凝胶组织化学方法和改良的测序方案，在小鼠脑组织切片中靶向了1000多个基因。2014年出现了一种无目标的方法可以捕获所有种类的RNA，称为荧光原位RNA测序（FISSEQ）。首先，使用常规的和修饰的胺碱与标记的随机六聚体RT引物混合在一起进行cDNA合成。最后，使用读取长度为30bp的SBL进行测序。但是，为了区分大量不同的靶标，可通过使用扩展的测序引物来应用分区测序策略，其中随机采样纳米球，从而仅对一个子集进行测序。2016年，成立了ReadCoor公司，该公司将该技术商业化。2020年，该公司公布了他们的第一条产品线，包括一个完整的集成系统，据说该系统能够在亚细胞水平上分辨同一组织切片上同时检测RNA，DNA和蛋白质。在2019年，FISSEQ的研究小组提出了原位转录组可行性测序。除了上述介绍的实验方法外，还可以计算方法构建空间的基因表达谱数据。这项技术通过分离单细胞基于他们的表达谱数据来计算他们的空间位置。细胞的空间定位可以基于他们的参考图谱实现，或是通过重头组装的方法实现。2015年，发表了两种使用ISH参考数据库的类似计算方法。第一个是将单细胞转录组数据整合到斑马鱼胚胎上，而其他数据则关注于海洋无脊椎动物。通过计算方法将组织划分为较小的区域来创建参考图谱，并根据ISH参考数据库将单个细胞定位到组织上。另一个算法DistMap发表于2017年，该算法是通过ISH参考数据库对单个细胞进行空间定位。这些方法适用于已知的生物样本和组织结构。使用现有的ISH数据库构建空间参考图谱，以便将分析限制于ISH图谱上已经存在的组织类型。基于参考图谱的方法的准确性取决于参考图谱的质量和可用性。因此，开发不依赖参考图谱重构空间定位的方法十分重要。这种方法称为NovoSpaRc。在没有参考图谱的情况下，可以基于在整个组织切片中基因表达的变化进行假设。其核心是相邻的细胞的表达模式比相距较远的细胞表达模式更相似。该方法已经在果蝇和斑马鱼胚胎等组织中得到证实，目前还需要做进一步的工作才能在更复杂的组织上获得详细的表达图谱。此外，作者指出一组具有已知表达模式的标记基因可以显著改善计算结果。上述介绍的方法是使用不同的策略获得空间转录信息。然而，这些策略的结果类似，一些具有出色分辨率的方法正在逐渐优化而且基于全转录组的捕获放在也在逐步提高其分辨率。目前，还有有一种方法得到空间分辨转录组的最终目标：无偏见，完整的转录组谱分析。为使用现有方法实现此目标，必须将这些方法结合起来并利用他们各自的优势。现在正在进行的大型项目，例如旨在创建人类细胞参考图谱项目，正在致力于解决以下问题：如何在不同平台上整合信息，将数据从不同模式下映射到参考图谱上。将空间和非空间的单细胞转录组数据整合到一起的计算方法是创建此类图谱的基础。目前，已经开发了其他几种方法来讲单细胞转录组数据和杂交或ISS数据融合，最近还可以将组织学成像数据与捕获数据融合。在使用此处介绍的空间方法时，作者想强调一些容易忽略的信息：a. FOV，即可以在单个实验中分析的组织的总大小，将在很大程度上决定该研究的可行性。例如，基于FISH的方法的FOV有限，并且依赖于大量的高分辨率图像。b.软件可用性，目前还有很多技术没有分析软件。尽管商业供应商正在开发自己的软件，而且学术界也在努力创建同一的分析流程，但研究该流域的研究人员目前还是创建内部软件来解决他们的特定问题。d.样本类型，尽管现在通常使用FFPE样本，但是大多数空间转录组学方法的样本只能是新鲜的冷冻组织。e.最后，当前技术的固有局限在于，他们只提供动态图谱。因此，对时空转录组学的研究是通过使用不同时间点的多个样本或使用非空间单细胞研究来进行的。毫无疑问，空间信息对推断更深层次的生物学意义具有重要意义，但是目前的技术限制了他的各种应用。尽管目前空间分辨组学在临床上已经有了一定应用，例如使用免疫组化和FISH技术。但如今，利用更全面的空间分辨转录组学分析组织样本在很大程度上是一项基础研究工作。但是，这些技术可能会成为个性化医学的重要工具，在一些组织中，局部作用的免疫反应和克隆可能对于治疗诊断十分重要。但是，这些技术应用于临床还需要解决工作流程复杂，费用较高等问题。目前，本文介绍的许多技术都没有解决这些问题，因此无法在临床上广泛应用。推动技术快速发展的一个重要因素是进行大量合作研究，以创建全面且公开的图谱。同时需要采用新的分析工具和标准化流程，以实现所有不同技术的集成，每种技术都具有独特的特征，数据合适和生物学优势。空间分辨转录组学领域正在加速发展，并且由于这些技术的发展可以使研究人员探索更多生物学信息。
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