重磅权威综述 | Nat Rev Nephrol：整合的多组学方法改进慢性肾脏病的分类
编译：Echo，编辑：Emma、江舜尧。
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目前，慢性肾脏病 (CKD) 根据其临床特征、相关并发症和活检损伤类型进行分类。即使在一个给定的分类中，疾病的表现、进展和对治疗的反应等方面也存在相当大的差异，这也突出了CKD潜在机制的异质性。因此，患者和临床医生在考虑最佳治疗方案和风险评估时都表现出诸多不确定性。随着生物技术手段的不断发展与进步，使得从CKD患者中获取包括DNA和RNA数据、蛋白质组和代谢组数据在内的大规模资料成为可能。应用机器学习等计算方法结合这些多维度的数据资料，将会给患者提供一个重新分类并定义一个亚群，以期更好的反映其潜在的疾病机制。CKD患者可以从这些整合的多组学方法中获益，因为用于生成这些不同类型数据的肾脏活检、血液和尿液样本可以在常规的临床护理中相对轻松获取。发展一个完整的分子分类的最终目标是为了改进诊断分型、危险分级和疾病特异的疗法分配以改善CKD患者的护理。
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前言
KD的诊断类型及其严重程度目前仍然是基于临床特征，如肾小球滤过率(GFR)、蛋白尿以及肾活检标本的病理学特征。然而，这种分类方法不能捕获表型相似的肾脏疾病相关的分子途径的多样性，此种方法会妨碍我们对长期结果的预估、测试和应用靶向治疗的能力。鉴于对疾病的分子基础的不完全理解以及无法预测患者反应，肾脏病学中阳性的临床试验的缺乏不足为奇。然而，过去10年见证了肾脏研究组学技术(尤其是转录组学和代谢组学)的激增。也正是这些研究导致了随后整合多组学研究数量的增加，这些研究有可能增强我们对肾脏疾病、影响疾病进展和介导细胞特异性治疗反应的分子过程的深入理解。通过将肾脏组织的分子组学特征与详细的遗传和表观遗传分析以及对患者预后的评估相结合，我们现在有能力识别细胞水平的生物标记物和药物靶点，并评估细胞对外界刺激的反应。因此，我们现在能够在多个数据类型和数据领域之间搭建信息的桥梁，以获得对肾脏分子层面的全面理解，从而指导精准医疗的靶向治疗研发。本文概述了整合的现有大量数据并举例说明了多种整合方法，以提高我们对慢性肾脏病分型及其机制的理解。
内容
1. 整合的多维度数据
肾脏疾病的研究特别适合利用跨多个数据领域的数据整合技术，因为在临床中遗传学、转录组、蛋白质组和代谢组数据所需的样本通常可以被定期收集。将遗传或表观遗传数据与分子、组织学和临床数据相结合，可以帮助描述遗传学和表观遗传学变异的功能相关性，并为它们如何影响肾功能提供新的见解。组织还可用于转录组或者特定肾小管节段的RNA测序以及单细胞RNA测序(scRNA-seq)，基于组织的蛋白组学和代谢组学也可以从活检样本中得到。此外，活检材料的数字图像可用于生成多维度、描述性和定量的病理数据，以便利用机器学习方法进行计算机辅助分析。此外，尿液样本可以作为“液体活检”，从中可以挖掘转录组、蛋白质组和代谢组数据，并与相应的肾脏组织其他相关数据进行整合，以识别尿液中反映肾脏细胞过程的非侵入性替代标志物，这样的多维度数据有可能为肾脏生物学的各个方面提供深刻的参考价值（如图1所示）。
图1 不同数据类型的整合对解决临床相关问题的帮助
2. CKD的相关通路和基因
CKD是一种以肾功能进行性丧失为特征的慢性疾病，可由多种病因引起，其病理过程和相关通路纷繁复杂。在我们目前的病因分类中，异质性存在于进展的风险和治疗反应中，这也突出了疾病中分子驱动因素可能存在明显的异质性。在过去的十年中，组学数据分析方法的进步使得CKD的复杂性能够通过整合各种遗传和组学数据来探索。如下所述，这些不同的数据可以聚合成与疾病表型或结果相关的通路和功能网络，以提高我们对相关通路的识别能力。
基因组学研究已经确定了与肾脏疾病相关的多种遗传变异，但遗传变异的功能影响及其在疾病中的潜在因果关系尚待确定。解决遗传变异对疾病影响的一种方法是通过表达数量性状位点(eQTLs)的识别，其多态性可以解释特定基因产物的RNA或蛋白质表达的某些变异情况，这些位点可以通过整合基因组测序数据和转录组或蛋白表达数据来识别。最早的相关研究之一是通过整合CKD患者的单核苷酸多态性(SNP)和转录组数据，证明了炎症反应和代谢途径之间的相互作用。此外，研究表明许多途径在不同病理诊断的疾病中是共同特点的，包括糖尿病肾病(DKD)、IgA肾病、狼疮性肾炎和局灶节段性肾小球硬化(FSGS)，突出强调了在不同疾病中介导肾脏损伤的共同下游途径。此外，肾特异性eQTLs已被用于识别疾病潜在的活性和靶点，如溶酶体A甘露糖苷酶。
创新的数据整合方法也被用来确定最佳的CKD模型系统，用于检测潜在的治疗靶点。例如，将人类肾脏活检样本的基因组规模的转录数据与临床前期CKD模型的转录数据进行整合，可用于定义CKD患者的关键调控中心，并确定最适合临床前期研究的相应模型系统。
有近似的网络层面匹配算法可成功地识别患者和三种小鼠模型之间常见的基因-基因交互网络。这种绘图方法具有广泛的用途，可以定义人类DKD活检数据的关键调节中心，同时可以指出最能模拟人类疾病的小鼠模型。该研究确定STAT3为小鼠和人类数据的中心节点之一，进一步提示了JAK-STAT通路在DKD发病中的作用。
对特定于疾病表型分子通路的识别也可以通过数据整合的策略进行探索。例如，肾小管间质纤维化是CKD进展的一个重要标志。因此，如果能够确定导致这一过程发生的途径，可能会产生相关的干预措施，从而广泛适用于各种疾病的病因。一项对活检样本的肾小管进行全基因组转录分析的研究发现，纤维化肾脏和正常肾脏之间存在代谢途径相关基因的差异表达。这些基因包括编码脂肪酸氧化关键酶的基因，例如CPT1A、CPT2、ACOX1、ACOX2和一些转录调节因子如PPARA和PPARGC1A。在叶酸诱导纤维化的小鼠模型中，与脂肪酸氧化相关的基因和酶的抑制发生先于纤维化，这表明其抑制作用不仅仅是对损伤的反应，而且很可能是疾病的病因之一。通过基因或药物的干预激活脂肪酸氧化，可以保护这些动物免受纤维化，这一假设也得到了证实。因此，这种方法不仅为肾纤维化进展的机制提供了新的思路，而且还可能为临床诊断类别提供新的方向。
3. 突破性的技术
新的技术和分析方法有助于我们对疾病过程的深入理解和认识。例如scRNA-seq和单细胞核RNA-seq(snRNA-seq)可以提供细胞水平上的分子过程，这对肾脏病学的研究将非常有帮助。
如前所述，前面章节中概述的数据整合的一些例子描述了在大块的组织样本或微分离的肾脏分子过程的图谱绘制，其在单一样本中混合多种异质的细胞类型，不能具体分辨是哪种细胞类型在不同疾病模型中发挥的作用。相比之下，肾脏的单细胞转录组侧重于不同的细胞，这些细胞可能会对损伤产生不同的反应，然而，对参与疾病过程的细胞特异性分子通路的分析，需要充分理解疾病的发病机制和对治疗的反应，并可能为细胞特异性药物的靶向治疗提供依据和前提条件。scRNA-seq的进步使得从肾脏等复杂组织中提取的数千个单个细胞的转录本能够被深入分析，为细胞类型和亚型的重新定义提供了重要支撑。这项技术发展的下一步需要利用细胞特异性基因图谱来识别与疾病进展相关的通路和分子靶点。在肾活检样本中应用scRNA-seq技术也是一个可行的策略，以确定单细胞发生的变化与疾病的发生和进展之间的关联。除了对病变肾脏内的细胞的定义和分类外，单细胞转录组学通过提供与疾病结果相关的细胞特异性转录变化，有助于改善CKD的分类，这些研究将导致CKD疾病的进展具备更完整的生物学模型。
研究肾脏的分子组成以及它是如何随着疾病发生变化的，已经从肾脏发育研究领域建立体外肾脏发生模型。这项工作的最终目标是开发出从多能干细胞中生成3D肾脏类器官的步骤，这些具体步骤可以用来模拟器官分化和发育的各个方面。尽管类器官研究的主要焦点是建立发育过程模型的方法，肾脏类器官也为揭示遗传性肾脏疾病的分子机制提供了新的思路和策略。类器官允许单细胞发育轨迹在以人类为基础的系统中被覆盖，这有利于研究肾脏疾病相关基因，如APOL1。对发育轨迹的分析使疾病轨迹可以在可扩展的系统中得到研究，该系统可以直接进行遗传或药理实验操作。因为肾脏的类器官可以从病人来源的可诱导的多能干细胞中生长出来(iPSCs)，这些来自患者的诱导多能干细胞为测试针对患者自身遗传背景的治疗效果和毒性提供帮助。
4. 肾脏病的精准医学
获得对CKD背后生物学过程更全面的理解的最终目标是提供个性化的治疗选择，并准确地预测个别患者的临床结果。精准医疗的中心原则是在正确的时间为正确的病人提供正确的治疗。考虑到肾脏的复杂性，我们预计与精准医疗目标相一致的预测方法的开发将需要整合各种数据类型，每种数据类型都能提供对生物过程和结果的观察。
肾小球滤过率(GFR)的下降是评估肾功能下降的典型指标。然而，尽管GFR的变化对血流动力学和肾小球变化敏感，但它们并不反映早期肾小管功能障碍和间质损伤。因此，GFR本身是一个不完整的CKD指标，不能代表其潜在的病理生理学，特别是在疾病的早期阶段。在尿液蛋白质组中识别损伤特征已被提出作为GFR识别早期肾功能不全或损伤患者的替代方法。尿蛋白质组学数据的优势是可用于预测风险、患者分类、目标接触以及肾功能预测。
通过将特定的数据特征，如基因、microRNA、蛋白或代谢物的表达与患者层面现有的临床和病理数据相联系，可以确定肾脏组织中特定结构变化的分子标记。在它们被识别之后，这些分子关联物与临床结果的相关性就可以被评估。类似的方法被用来揭示DKD的长期进展的分子机制，一项研究使用了来自临床前或早期DKD患者肾活检标本的特异性基因表达谱，以确定活检时的转录表达谱是否可以预测疾病进展。
上述方法提供了与CKD的发展和进展相关的疾病模型、途径、网络和基因的综合分析。然而，这些方法不能定量地比较不同患者或单个患者特定通路的激活水平以及预测对特定治疗反应的可能性所必需的信息。转录标记的定量评分已被用于识别与肾脏疾病相关的各种标记，包括肾小球疾病患者中重新激活的足细胞发育的标记，罕见肾病中免疫代谢通路激活的标记，FSGS患者对类固醇反应的内皮细胞特征和FSGS患者JAK-STAT信号升高的证据。生物标志物的使用，以帮助识别患者的JAK-STAT通路激活和FSGS将是评估该疾病中药物疗效的关键。
组学数据分析所面临的挑战是样本量通常是有限的，这就难免会限制立组群中重复研究结果的能力。机器学习方法也可用于描述与CKD结果相关的脂类组学数据。尽管队列研究中参与者数量有限，这突出了这种方法在研究罕见疾病和其他小群体病例方面的潜力，其他用于肾脏疾病的机器学习方法在其他地方也有描述。
5. 在线工具
在过去的十年里，一些数据探索平台的开发使研究人员能够使用各种生物信息学方法生成相关的资料，转化体外和体内的实验结果，评估疾病相关的通路、网络、潜在靶点和生物标志物。几个关键的基于网络的肾病研究相关平台，从中可以探索不同RNA表达谱、eQTLs、scRNA-seq数据，基因网络相互作用，基因和蛋白的共同表达以及组织特异的功能分析（如表1所示）。
表1 基于网络的肾脏病数据挖掘转化工具
开源数据库和分析平台tranSMART106最初是由公私合作开发的，现在已经被用作有效的数据探索工具，使研究人员能够在多个队列研究中共享数据。美国国立卫生研究院为研究机构指定的临床和转化科学奖促进了转化健康研究的科学研究，也促进了学术机构内部和跨学术机构的合作，也促进了大量广泛报道的临床队列研究生成整合的数据（如表2所示）。
表2 基于合作的数据资源整合
本综述中描述的许多分析方法都遵循类似的模式，将在线数据呈现给其他基于网络的资源。开放数据是使用基于网络的数据探索工具的关键。以下是一个基于网络的搜索引擎，Nephroseq数据库（如表1所示）可以让研究人员根据他们的具体知识和兴趣与现有的大规模数据联系起来以制定和（或）验证假设。表1是一个基于网络的数据库，它结合了一些公开的肾脏基因表达谱和分析工具，用于数据挖掘和基因表达数据的可视化。因此，对来自不同潜在病理条件的CKD患者肾小球样本和健康活体组织之间差异表达的基因进行Meta分析，表明这些疾病在上调和下调基因方面具有许多共同的分子信号，利用热图可以将相似的表达谱做到可视化（如图2所示）。虽然上面的例子说明了数据共享的力量，但对未被识别的人类数据的隐私保护是至关重要的，特别是在基因组和RNA测序时代。最后，使用联合数据库有助于隐私的保护，它可以使大规模的数据整合研究，通过远程安装算法在不同的数据库上执行，而单独的数据被保存在他们的保护环境中。
图2 公共数据库的使用为肾脏疾病通路探索提供思路
结语与展望
正如在这篇综述中所述，数据整合方法是描述病理和临床疾病分类中未发现的肾脏疾病分子异质性的关键。随着组学数据在患者群体中的应用越来越广泛，结合不同的生物技术和网络平台，将是揭示相关疾病发展和转归的核心。例如，整合的技术不仅需要整合两个数据领域，还需要同时整合临床数据、代谢组学、组织病理学和转录组数据，以充分了解疾病过程。相似网络融合和多组学因素分析等方法已成功用于跨领域数据整合(例如转录组学、甲基组学和蛋白质组学)和其他疾病领域的平台，可以相对统一对疾病的认识和理解。此外，必须谨慎地限制整合“大数据”方法可能产生的错误论断。尽管适当的统计数据的使用在识别和纠正错误发现方面确实有一定的作用。随着肾脏病学开始向精准医疗方向的发展，最终目标将是在临床中定义准确的疾病分类过程，借助生物技术、网络信息平台和机器学习等手段，从而针对不同的患者使用更为有效准确的药物来改善诊断、预后和个性化的治疗策略。