科研| Microbiome：小鼠微生物组与记忆之间的遗传和代谢联系
编译：北越城主，编辑：谢衣、江舜尧。
原创微文，欢迎转发转载。
论文ID
原名：Genetic and metabolic links between the murine microbiome and memory
译名：小鼠微生物组与记忆之间的遗传和代谢联系
期刊：Microbiome
IF: 10.465
发表时间：2020.04.17
通讯作者：Antoine M. Snijders
通讯作者单位：劳伦斯伯克利国家实验室
实验设计
实验结果
我们使用被动回避实验评估了来自29个协同交叉小鼠（CC）品系的535只小鼠的海马功能依赖性记忆。在不同的CC品系之间，记忆能力存在明显且可重现的变化（图1a）。测试当天的入场时间延迟范围为87.9到600 s（图1a）。来自两种品系（CC036和CC010）的小鼠在600 s的测试时间内从未进入过小室。我们观察到其中两种品系（CC019和CC032）的记忆力存在性别差异，其中雄性小鼠的记忆力较高，而其他任何品系均未观察到明显的性别差异。
在整个CC队列中，记忆潜能的可再现变化表明宿主遗传学在记忆中起着重要作用。为了确定有助于记忆的潜在遗传变异，我们在29个CC品系中对76080个SNP进行了GWAS分析。我们鉴定出715个与记忆力显着相关的SNP（p <10-12），对应于222个带注释的基因（图1b）。基因集富集分析表明，222个基因在与学习或记忆（p = 1.87E-5），神经元细胞成分（p = 3.97E-9）和异常学习/记忆/条件表型有关的生物学过程中显着富集（p = 1.03E–4；图1c）。除了已知与记忆和学习相关的71个基因外，我们的筛选还根据来自老鼠脑图谱（Allen Brain Atlas）的原位杂交数据，鉴定了135个以前与记忆无关的基因，包括65个在大脑中表达的基因）。空间基因表达数据表明这65个基因可能在记忆中起作用。
图1鉴定与CC小鼠记忆有关的遗传变异基因 a不同CC品系小鼠的记忆变化，在第0天，进入电击舱的入口显示为蓝色，而在发生脚部电流刺激3天后的进入则显示为绿色（第3天），具有记忆力良好的小鼠避免在第3天进入小室，而具有记忆力差的小鼠进入小室；b 用于CC小鼠品系GWAS分析的曼哈顿图（n = 535小鼠），该图上方列出了先前与具有代表性的QTL中的记忆，认知或其他神经发育过程相关的候选基因；c在图1b中对与记忆潜能相关的QTL中鉴定的基因进行基因本体论（GO）分析（n = 535只小鼠）。
为了确定肠道微生物组的特定成员与记忆之间的联系，我们使用16S rRNA基因序列数据与单个CC品系的记忆相关联分析。将序列数据对应于72个细菌家族的5761个OTU。在将OTU过滤为具有> 100个读数的OTU之后，剩下41个家族。四个科（乳杆菌科，脱铁杆菌科，拟杆菌科，梭菌科）与记忆力显着相关（p <0.05；图2a）。风险比（HR）表明，较高丰度的乳酸杆菌科细菌（特别是罗伊氏乳杆菌；HR = 0.79）和脱铁杆菌科细菌（HR = 0.73）和较低丰度的拟杆菌科（HR = 1.32）和梭菌科（HR = 1.32）的能够改善记忆潜力（图2a）。而此前的大量研究也证实了乳杆菌科能够显著改善老鼠，人类等的记忆能力。因此我们将剩下的研究重点放在乳杆菌，特别是本研究中确定的罗伊氏乳杆菌（L. reuteri）。
为进一步研究乳酸杆菌对记忆的影响，我们通过罗伊氏乳杆菌F275口服灌胃给无菌（GF）小鼠进行微生物定殖。该细菌具有与OTU完全匹配的16S rRNA基因序列，这与提高的记忆力显着相关。此外，我们还进行了其他两个乳杆菌种（L. plantarum BDGP2和L. brevis BDGP6）进行比较。在我们的三个微生物定植组中，我们验证了单个乳杆菌OTU的存在，每个OTU在单个治疗组中占主导地位，并且可以追溯到我们接种的物种。使用相同的被动回避测试在接种乳杆菌的小鼠中评估记忆，并与具有相同遗传背景的GF小鼠进行比较。包括大肠杆菌DH10B接种的小鼠作为阴性对照。我们的数据显示，与GF小鼠相比，所有与乳酸杆菌相关的小鼠均显示出显着的记忆改善（p <0.001；图2b）。相反，我们观察到在接种定植大肠杆菌DH10B后的小鼠记忆力没有改善（图2b）。
图2乳杆定植对GF小鼠记忆力的影响a通过多变量Cox回归分析鉴定CC小鼠中与记忆有关的微生物；b与单独接种或未接种大肠杆菌的对照组相比，用单个乳杆菌（罗伊氏乳杆菌F275，植物乳杆菌BDGP6或短乳杆菌BDGP2）接种GF小鼠可显着提高记忆力
为了鉴定由乳杆菌产生的代谢物，我们对粪便样品中的代谢物进行了代谢组学分析（图3a）。LLE（局部线性嵌入分析）图显示，来自乳酸杆菌定殖小鼠和GF小鼠的粪便样品中的代谢产物组成截然不同（p = 0.00021；图3b，c），表明接种乳酸杆菌会明显影响肠道代谢组。根据气相色谱-质谱（GC-MS）峰强度，从三个菌株中的任何一个定殖的小鼠收集的粪便样品中，乳酸和苏糖醇始终较高（p <0.01；图3d，e），但在肠道代谢产物中观察到一些菌株特异性差异，例如D-甘露醇仅在罗伊氏乳杆菌接种的样品中更高（p <0.001；图3f）。但是随后向小鼠注射甘露醇不会增强记忆力。在来自乳杆菌接种的小鼠的粪便样品中显示出较高水平的其他代谢物包括：半乳糖酸（罗伊氏乳杆菌）；D-木糖，甘油酸和磷酸甲酯（植物乳杆菌）；尿嘧啶（短乳杆菌）。同样，许多与“碳水化合物”相对应的GC-MS峰，在用乳杆菌属菌种定居的粪便样品中丰度降低，表明这些组分在被接种细菌后降解（图3a）。
图3乳杆菌定殖和无菌小鼠粪便样品的代谢组学分析a无菌和乳酸菌定殖的小鼠粪便样品中代谢物谱的代表性GC-MS色谱图；b在粪便样品中测量了代谢物谱的PCoA图；c乳酸菌定殖和无菌小鼠之间的代谢物热图；d–f个别小鼠粪便样品中特定代谢物的相对丰度。
为了确定哪些代谢物可能是记忆反应的介质，我们还鉴定了与GF小鼠相比，定植小鼠血浆和脑匀浆中明显更高的特定代谢物（图S3）。在血浆和大脑中，物种之间的代谢产物差异较小，除了较高的血浆中阿糖醇，柠檬酸，葡萄糖和L-色氨酸的含量（植物乳杆菌；图S3B）。在脑匀浆中，特定代谢物的差异包括D-苹果酸，脱氢抗坏血酸，GABA，乳酸，磷酸甲酯，肌醇和鞘氨醇（植物乳杆菌）的水平明显较高；和甘氨酸（罗伊氏乳杆菌；图S3C）。与GF对照相比，在罗伊氏乳杆菌或植物乳杆菌接种的小鼠中脑代谢物的实例明显更高，包括甘油，L-谷氨酸，L-丝氨酸和N-乙酰基-L-天冬氨酸（图S3C）。同样，对于植物乳杆菌和短乳杆菌，小鼠的脑匀浆中的2,5-二羟基吡嗪和柠檬酸均显着高于GF对照（图S3C）。
因为我们发现三种乳酸菌中的每一种都能改善的记忆能力，所以我们集中于粪便代谢产物，与GF对照相比，这三种细菌在粪便中的代谢产物丰度始终较高（图S3），统计学上包括较高的乳酸水平（p <0.05, 图3d），D-苏糖醇（p <0.05，图3e），2-羟基异戊酸和乙酰基丝氨酸（p <0.05，图S3A）。有趣的是，与GF对照相比，接种了三种乳杆菌的小鼠粪便样品中的甘油含量显着降低（图S3A）。在血浆样品中，与GF对照相比，所有接种乳杆菌的小鼠中1,5脱水己糖醇，碳酸根离子，丙酮酸和木糖醇均显着更高（图S3B）。但是，与GF对照相比，在乳杆菌接种小鼠的脑匀浆中，没有一种鉴定出的代谢产物丰度明显更高（图S3C）。然而，乳酸菌确实在血浆和大脑中都有趋向更高水平的趋势，并且在接种植物乳杆菌的小鼠的大脑样本中明显高于接种大肠杆菌对照小鼠（p <0.05，图S3C）。
图S3 乳酸菌定植的无菌小鼠的粪便，血浆和脑样品的代谢组学分析，GF和乳杆菌接种小鼠的粪便（A），血浆（B）和脑（C）样品中代谢物的相对丰度水平。
基于这些代谢物数据和其他关于乳酸在记忆形成中的作用的研究，因为所有乳酸菌通常都产生乳酸，我们假设在我们的试验中，乳酸可能是改善记忆反应的介质。另外，最近显示，食用含有乳酸杆菌和双歧杆菌菌株的膳食补充剂的大鼠脑样本中的乳酸含量更高，其结果是大鼠的记忆力得到了改善。因此，我们进行了一项实验，以确定用补充乳酸治疗的小鼠是否具有改善的记忆力。CC042小鼠在被动回避记忆测试中具有相对较差的记忆（图1a），通过灌胃乳酸治疗5周（0.5 g乳酸/ 100 ml水）。我们发现，饮食中的乳酸治疗可将CC042小鼠的平均保留潜伏期从92秒提高到210秒（p = 0.01；图4）。
图4饮食中添加乳酸治疗可显着增强CC042小鼠的记忆力，通过饮用水（n = 20；0.5 g乳酸/ 100 ml水）用乳酸治疗CC042小鼠或对照组（n = 20）5周。使用被动回避来评估记忆。饮食中的乳酸治疗可将CC042小鼠的平均保留潜伏期从92秒显着提高到210秒。
为了进一步确定在补充乳酸杆菌或乳酸后小鼠体内改善的记忆反应的机制，我们使用取自治疗小鼠的脑冠状切片，对海马体内的GABA含量进行了定量，包括四个海马角（CA）和齿状回（DG）。我们选择专注于海马体，因为它是获取和形成新记忆的重要区域，其中大脑中主要的抑制性神经递质GABA在其中起着至关重要的作用。如上所述，使用代谢组学分析，我们发现接种植物乳杆菌的小鼠脑匀浆中的GABA水平显着升高，而其他两种物种则不存在。尽管在较低的显着性阈值下罗伊氏乳杆菌样品中的GABA水平也较高（p = 0.065；图S3C）。使用免疫荧光，我们定量了海马中的GABA表达（图S4），并比较了GF对照和三个乳酸杆菌定植的小鼠组之间的GABA表达（图5a，图S4）。与无菌对照小鼠相比，所有乳酸杆菌定植的小鼠均表现出在海马中表达更高比例的GABA细胞体（图5b）。
但是，我们的代谢物数据显示，与对照组相比，接种小鼠的粪便或血浆样品中的GABA没有明显增加。有趣的是，我们发现与对照小鼠相比，单独使用乳酸盐处理还可以使表达GABA的细胞体分数从32％增加到43％（p = 0.042；图5c），支持了乳酸可以作为脑肠轴两者之间的代谢通道的假设。
图5接种乳酸杆菌或乳酸处理对小鼠海马中神经递质γ-氨基丁酸（GABA）水平的影响。 a GABA免疫染色的代表性图像，取自无菌小鼠和罗伊氏乳杆菌，植物乳杆菌和短乳杆菌处理过的小鼠的齿状回中的细胞体层；b接种乳酸杆菌（每种治疗方法分别为4例包括2例雄性和2例雌性）c或乳酸治疗（每种治疗方法分别为6例包括3例雄性和3例雌性）与GF或者空白组小鼠相比均显着提高了海马体GABA水平。
观察到的海马中GABA表达增加的潜在机制可能是该大脑区域中谷氨酸脱羧酶（GAD）的表达水平增加，该酶将谷氨酸转化为GABA。为了测试这种可能性，我们使用基于单分子的荧光原位杂交方法（fliFISH）量化了齿状回中GAD67基因的表达水平。但是，我们发现在无菌小鼠和定植有乳酸杆菌菌株的小鼠中GAD67基因表达水平之间没有显着差异（图S5）。在我们的研究中使用的乳酸杆菌分离物的序列分析表明，短乳杆菌有两个编码谷氨酸脱羧酶的基因，而植物乳杆菌和罗伊氏乳杆菌每个都有一个，这表明乳杆菌可能是海马中GABA水平升高的来源。观察到的经乳杆菌定植的小鼠海马中GABA升高的另一可能机制是非氧化性代谢，以及通过α-酮戊二酸转氨作用将乳酸转化为GABA。这些假设仍有待进一步研究验证。
图S5无菌小鼠和定植于不同乳酸杆菌菌株的小鼠的齿状回中谷氨酸脱羧酶（GAD67）的表达水平A.从定植植物乳杆菌的小鼠的冠状脑切片拍摄的海马代表图像； B-D B，C和D中重叠的荧光和DIC图像是四个小区域中三个中的三个的高放大倍率图像，分别在A中标记为1、2和3。基于波动定位成像的荧光原位杂交（fliFISH）用于计算每个小区域中的转录本（红点）数量。每个治疗组使用两只雄性和两只雌性小鼠。比较相似区域之间的转录本计数或比较四个区域的转录本总和时，在乳酸杆菌定植的小鼠和GF小鼠之间没有发现显着差异。
为了进一步评估我们的发现对人类宿主的可转录性，使用HuMiX模型对罗伊氏乳杆菌和人上皮细胞（Caco-2）进行了共培养实验（图S6A）。HuMiX是一种基于微流体的人类-微生物共培养系统，旨在模拟人类胃肠道的环境，在该环境中，微生物和哺乳动物上皮细胞通过可溶性分子因子相互作用。上皮细胞完全分化成极化单层细胞后（7天后）接种细菌细胞。从细菌和上皮细胞灌注室收集的液体样品中，在两个时间点（孵育后6小时和24小时，以及刚开始接种之前作为基线）测量代谢物。与体内研究相似，我们观察到乳酸和甘露醇随孵育时间增加（图S6B-C和表S7）。我们专注于乳酸，发现与未接种对照相比，在接种罗伊氏乳杆菌的细菌和灌注室中其含量都高得多（图S6B）。这些结果表明罗伊氏乳杆菌产生的乳酸可以扩散到腔室的另一侧，表明它可能通过人体的肠道上皮细胞内膜扩散，并通过血流传输到大脑。
结论
这项研究提供了新的证据，在复杂的遗传-微生物组-代谢组相互作用对于记忆功能的改善。这项研究的一项潜在成果是支持使用益生菌乳杆菌菌株通过产生乳酸和促进海马中GABA水平的升高来改善记忆，尽管仍有待将这些发现从小鼠转化为人类。此外，我们的发现表明，饮食中乳酸菌改善记忆能力的潜在代谢机制可能至少部分是由于结肠中乳酸的产生，该乳酸通过血液传输至大脑。
评论
1.在CC小鼠模型中鉴定出与短期记忆相关的715个SNP，主要富集于参与学习和记忆功能的基因；
2.菌群分析表明，乳杆菌科和脱铁杆菌科与记忆力正相关，拟杆菌科和梭菌科与记忆力负相关；
3.给无菌小鼠单定植乳杆菌菌株，能显著改善小鼠记忆，而定植大肠杆菌则无此效果；
4.定植乳杆菌后，小鼠粪便中乳酸等多种代谢物水平升高，口服补充乳酸能增强常规小鼠的记忆；
5.定植乳杆菌或补充乳酸，能使小鼠海马中的神经递质GABA水平升高。
原文网址：https://doi.org/10.1186/s40168-020-00817-w