科研 | 哈佛：利用3D肿瘤球体模型结合CRISPR-Cas9筛选研究NRF2超激活介导的分子发病机制
编译：Y.too，编辑：Tracy、江舜尧。
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稳定NRF2(一种氧化防御转录因子)的癌症相关突变可以促进肿瘤的发展。在本篇文章中，我们利用3D肿瘤球体模型结合CRISPR-Cas9筛选，研究了NRF2超激活介导的分子发病机制。NRF2的过度激活对肺肿瘤球状体的增殖和生存是必要的，抗氧化治疗挽救了生存但不能促进增殖，这表明存在独特的机制。CRISPR筛查显示，球状体不同程度地依赖于哺乳动物雷帕霉素(mTOR)的增殖靶点和脂质过氧化物酶GPX4的保护，以防止内基质缺失细胞的铁死亡，铁死亡抑制剂阻止了NRF2下调导致的死亡，表明NRF2在保护基质缺失的细胞免于铁死亡中发挥了重要作用，而蛋白质组学分析显示，包括GPX4在内的硒蛋白通过NRF2下调而在全球范围内富集，并以NRF2和GPX4为靶点，大致杀死了球状体。这些结果说明了球形培养在揭示环境或空间上对NRF2的差异依赖性方面的价值，并揭示了NRF2过度激活肿瘤的可利用弱点。
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实验设计
1. 通过构建稳定高表达NRF2的非小细胞肺肿瘤细胞株探究NRF2对传统的二维单层和三维球形培养中的影响；
2.采用CRISPR-Cas9介导的KEAP1敲除来稳定表达NRF2探究肿瘤球形细胞的增殖和存活与NRF2的关系；
3. 采用全基因组筛选方法确定NRF2介导球状细胞生长的关键基因；
4. 采用基于TMT蛋白质组学技术，结合CRISPR-Cas9敲除技术和抑制剂干预方法探究NRF2调控球形细胞内部清除的细胞死亡机制。
实验结果
1. 与二维单层细胞相比，NRF2活化的3D球状肺癌细胞更依赖于NRF2生存和增殖
为了研究NRF2在传统的二维单层和三维球形培养中下调的影响，我们构建了A549和H1437非小细胞肺肿瘤细胞株，它们在多西环素控制下表达两种不同、可诱导的针对NRF2 mRNA短发卡RNA(shRNAs)。这些肿瘤细胞系表现出NRF2的组成性激活(高激活)，是由于KEAP1基因失活可导致NRF2稳定。而相对于2D培养，NRF2下调在3D培养中导致的细胞数量减少更为显著(图1A)，此外，在将亲本细胞与红色荧光蛋白(RFP)阳性的shControl或shNRF2细胞共培养时，与在2D培养相比，shNRF2细胞在3D培养中的竞争更明显(图S1A)，这表明在3D培养条件下，这些肿瘤细胞更依赖NRF2来维持生存或增殖。H1437和A549细胞数量减少程度与NRF2表达和NRF2活性的降低有关，这是通过测定其靶细胞NQO1转录水平确定的(图1B)。
球粒的生长可分为两个阶段:早期的高速增殖阶段，即单细胞开始形成球粒的阶段(大约在培养的第一周)，接着是培养的第二周增殖阻滞阶段。在3D培养中，经过8天(即早期)生长后，NRF2敲低的球状体比未敲低的球状体要小(图1C和1D)，其中H1437的效果更为明显。此外，在NRF2敲低的球体中，细胞增殖标记Ki67的免疫荧光染色也降低(图1C和1E)，这些数据表明，在三维培养中NRF2在早期增殖阶段调节了球体生长。
3D培养12天后(即后期)，NRF2敲低导致A549球状体内基质缺失细胞清除(图1F-1I)。因为从3D培养开始NRF2敲除就会极大地抑制H1437细胞中球状体的生长，所以我们在加入强力霉素之前培养了H1437球状体1周，使球状体变得足够大，以评估NRF2敲除对细胞内部清除的影响(图1G)。与A549球状体一致，在形成H1437球状体后诱导NRF2敲低，可以导致内部细胞的清除(图1F-1I)。这些结果表明，NRF2在球体形成的后期控制着内部基质缺失细胞的存活。NRF2基因敲除诱导的观察表型是靶向的，因为转染shNRF2发夹(图S1B-S1D)不靶向的NFE2L2突变体(NRF2*和NRF2**)挽救了内部细胞增殖和存活率的降低(图1J-1N)。
图1 NRF2的下调显著影响3D培养细胞的生长
(A)所示细胞系在2D和3D培养条件下的生长。(B)三次独立实验2D培养后，NRF2和NQO1在指示细胞株中诱导72 h后的mRNA表达。数据归一化为shControl。(C)三个独立实验所示椭球体的代表性共焦图像。(D)从(C)描述的实验中定量球形大小(n =55-112)。(E) 从(C描述的实验中Ki67信号相对于shControl的定量)(n= 22-46)。(F)三个独立实验所示椭球体的代表性共焦图像。(G)(F)中的强力霉素治疗时间表（1 mg / mL）。(H)内部空间的定义和填充百分比的计算。(I) (F) (n = 45-77)描述的实验中填充的内部空间百分比。(J)两个独立实验中所示椭球体的代表性共焦图像。(K)在指定的第8天的椭球大小的定量(n = 59-150)。(L) 在第8天(n =59-150)中Ki67信号的定量。(M)两个独立实验所示椭球体的代表性共焦图像。(N)( M)中描述的实验填充的内部空间的百分比(n=14-22)。
2. 高NRF2活性是肺癌有效形成球状体所必需的
为了进一步评估NRF2对球状体生长的影响，我们在一个大的肺癌细胞系中研究了NRF2激活状态与球状体生长的关系。考虑到NRF2的过度激活不仅是由NRF2通路的基因改变引起的，还包括其他因素，比如致癌基因和未知机制，我们首先获得了NRF2基因信号来量化每个细胞系中NRF2的激活程度。
为了获得NRF2基因信号，我们在癌症基因组图谱(TCGA)项目中从NRF2通路中经常发生基因改变的四种癌症类型(LUSC、LUAD、头颈部鳞状细胞癌[HNSC]和宫颈鳞状细胞癌[CESC])中挖掘了主要患者数据。我们发现1466个基因在NRF2通路中具有NRF2过度激活基因改变(NFE2L2突变/扩增或KEAP1或CUL3突变/缺失)的肿瘤中的表达显著高于或低于没有NRF2过度激活基因改变的肿瘤(p < 0.05;图2A;表S1)。我们通过选择在LUSC中与未改变的肿瘤相比更高表达的基因，以及其他三种肿瘤类型中至少两种（图2B和2C；表S1），得出55个基因NRF2信号。NRF2标记基因的中位数标准化表达值被用作“NRF2评分”，作为一组癌细胞系NRF2过度激活的指标(图2C;表S2)。
与3D培养的NRF2敲除数据一致，NRF2得分较低的肺癌细胞系不能有效地形成球状体，而且肺癌细胞系的NRF2得分与球状体大小相关(图2D和2E)。在NRF2通路中没有基因改变但表现出较高NRF2得分的细胞系(即H520和SK-MES-1细胞)形成球状体，而在NRF2通路中有基因改变但表现出较低NRF2得分的细胞系(即H23细胞)不形成球状体。在H520和SK-MES-1细胞中，NRF2基因的表达降低了球形细胞的大小，增加了内层细胞的清除，而过表达NRF2**挽救了内层细胞球形细胞的生长和存活(图S1E–S1P)，小部分表现出中间NRF2评分的H596细胞形成了球状体，但它们只表现出强烈的内部清除率(图2D，箭头)，因此这些结果表明，至少在肺癌细胞系中，高的NRF2活性对于有效形成球状体是必要的。
我们进一步研究是否可以通过CRISPR-Cas9介导的KEAP1敲除来强制稳定NRF2增强肺癌细胞系的球形大小和内细胞的生存，这些细胞系在NRF2通路中没有基因改变，且表现出低或中等的NRF2得分：H226 H596。我们通过NQO1表达增加证实了KEAP1敲除增加了NRF2蛋白的表达和活性(图2F和S1Q)，KEAP1敲除增加了两株细胞系的球状体大小(图2G-2J)，并减轻了H596细胞内球状体的死亡(图2I和2J)。这些数据提供了额外的证据，即表明高NRF2活性可促进肺癌细胞高效的球状形成。
LUSC和LUAD原发性患者肿瘤的NRF2评分与增殖特征评分呈正相关(图S2A和S2B)，表明了NRF2活性与人类肿瘤增殖之间的潜在关联。而在一组肺癌细胞系中，NRF2评分与二维细胞生长没有相关性(图S2C和S2D)，暗示NRF2的过度激活并不能解释肺癌细胞系二维增殖的差异。
图2 高的NRF2活性是高效的球状体形成所必需的
(A) TCGA LUSC样本中与NRF2超活化相关的基因(n = 198)。(B)维恩图显示了TCGA癌症类型中与NRF2超活化相关的基因数量。(C) 55个NRF2信号基因在675个癌细胞系中的表达。(D)肺癌细胞系第16天球形的代表性图像。(E)从(D)中描述的实验中得出NRF2评分与球体大小的相关性。(F)三个独立实验所示细胞系中NQO1 mRNA的表达。(G)两个独立实验所示第14天椭球体的代表性共焦图像。(H)从(G)描述的实验中定量球形尺寸(n = 65-97)。(I)两个独立实验显示的第12天椭球体的代表性共焦图像。(J)从(I)描述的实验中量化球体大小和填充内部空间的百分比(n = 53-91)。
3. 抗氧化剂能挽救生存，但不能挽救NRF2下调引起的增殖缺陷
考虑到NRF2调节细胞抗氧化程序，我们研究了2D和3D培养条件下的细胞氧化还原状态。与2D培养相比，3D培养显示了更高的ROS水平和更低的GSH/GSH二硫化物(GSSG)水平(图3A和3B)，表明与单层细胞相比，球形细胞受到了更多的氧化应激。氧化应激的诱导在第10天更为明显，可能是由于3D培养后期的内球形细胞中存在较强的氧化应激。虽然除第10天外，3D培养组的NRF2 mRNA在任何时间点的表达均与2D培养组相当，但NQO1的表达在3D培养组更高(图S2E)，这一结果表明，尽管A549和H1437细胞中KEAP1失活，但NRF2仍有能力被ROS进一步激活，并且在3D培养中选择了携带高度活化NRF2的细胞。
接下来，我们研究了抗氧化处理是否可以挽救NRF2敲除诱导的内球形细胞清除和增殖减少。NRF2敲除后腔内A549和H1437细胞的存活率通过抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)或GSH乙基酯(GSH-EE) (GSH-EE是GSH的一种透膜衍生物)显著提高(图3C-3E)。相比之下，这些抗氧化剂并不能根据Ki67信号或H1437球状体的大小挽救NRF2缺失的球状体增殖(图3F-3H)，这表明抗氧化反应不足以促进NRF2介导的球状体增殖。因此，这些结果表明NRF2通过不同的机制调控肺癌球样内基质缺失细胞的存活和增殖。
图3 抗氧化处理可挽救内细胞的存活，但不会因球状体中NRF2的下调而导致增殖的丧失
(A)三个独立实验结果显示的球粒中相对于单层细胞的ROS水平。(B)三次独立实验2D或3D培养的细胞中GSH/GSSG比值。(C和D)两个独立实验所示椭球体的代表性共焦图像。(E) (C)和(D)实验中填充的内部空间百分比(n = 10-64)。(F)两个独立实验中所示椭球体的代表性共焦图像。(G)从(F)描述的实验中定量球形尺寸(n = 4 24)。(H)对NAC-和GSH-EE未处理球体的Ki67信号进行定量，shControl来自(F)中的实验(n = 4 24)。
4. 2D与3D培养中的CRISPR-Cas9筛选揭示了NRF2高活化癌细胞中球状体生长的依赖性
为了鉴定介导NRF2高激活诱导球状生长的关键基因和/或程序，并确定NRF2高激活肿瘤的候选依赖关系，我们在A549和H1437细胞中进行了聚合CRISPR-Cas9筛选。我们选择使用稀疏镀的球状体在全基因组筛选最有可能在NRF2高活化癌细胞中起作用的基因，这些基因与人类肿瘤中过度激活NRF2的基因改变显著相关 (图2A、2B和4A)。由于抗氧化剂在3D模型中涉及肿瘤发生和存活，因此我们还纳入了一组氧化还原调节基因和其他文献中推荐的NRF2调节基因。此外，我们还纳入了通过NRF2网络分析(GeneGO)或现有功能基因组筛选数据分析的基因。通过去除在肺肿瘤或KEAP1/CUL3/NFE2L2改变的细胞系中低水平表达的基因，以及与NFE2L2共扩增或与KEAP1/CUL3共删除的基因，来削减该列表的基因个数(图4B)。文库中还包括一些非靶向性和阳性对照单导向RNA (sgRNAs)，共有14058个靶向1500个基因的sgRNAs(图4B;表S3)。
考虑到NRF2抑制对2D细胞生长的影响不如3D球形细胞生长的影响强烈(图1A和S1A)，我们的筛选方法是在2D和3D培养条件下，同时在A549和H1437细胞中进行聚合CRISPR-Cas9筛选，以识别重要的基因，特别是对于球形生长(图4C)。图4D显示3D培养条件下与2D培养条件相比，两种细胞系富集(3D-2D β-score阳性)或缺失(3D-2D β-score阴性)的细胞。两种细胞系球形生长过程中，靶向41个基因的sgRNAs均为正向选择，靶向23个基因的sgRNAs均为负向选择(所有CRISPR筛选结果见表S4)。有证据表明，NFE2L2及其结合伙伴MAFG在两种细胞系中都是dropout hits，在3D培养条件下比2D培养条件下消耗更大，这是对CRISPR筛选方法的验证。此外，dropout hits包括编码糖酵解和磷酸戊糖途径酶的三个基因：甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、葡萄糖-6-磷酸异构酶(GPI)和转酮醇酶(TKT)，它们都是葡萄糖代谢进入/退出磷酸戊糖途径(PPP)的重要分支。NRF2对这些酶的依赖与之前的报道一致，即NRF2通过将葡萄糖代谢重定向到PPP来支持细胞增殖，而在3D培养条件下，最显著的依赖作用包括靶向TSC1 sgRNAs的富集和靶向GPX4 sgRNAs的耗尽。
图4 利用CRISPR筛选NRF2超激活细胞系的球状体依赖关系
(A)聚焦CRISPR文库的基因鉴定示意图。(B)聚焦CRISPR文库中基因来源的分布。(C)聚合CRISPR筛选方法示意图。(D)击中A549和H1437细胞系的共同基因。对于每个细胞系，绘制3D和2D生长培养条件下β-score的差异。
5. TSC1和GPX4的缺失分别增强了球状体的增殖和内部清除
TSC1与TSC2合二为一，是mTOR信号的上游抑制因子。在CRISPR-Cas9筛选中，靶向TSC1的sgRNAs富集表明，mTOR信号的激活为3D培养条件下的生长提供了适应度优势，而来自癌症药物敏感性基因组学的药物敏感性数据分析的研究表明，NRF2评分高的肺癌细胞系对磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/mTOR抑制剂BEZ235(图S3A)和雷帕霉素模拟物替西罗莫司(图S3B)的敏感性增强，表明NRF2过度激活的肿瘤更依赖于mTOR信号。
为了详细研究TSC1缺失对球体生长的影响，我们在之前生成的NRF2敲除或不敲除的A549和H1437细胞中使用CRISPR-Cas9敲除TSC1(图S3C)。在这两种细胞系中，TSC1的缺失增加shControl细胞的球状体大小，而shNRF2细胞则没有增加球状体大小(图S3D-S3G)。shControl中观察到的球状体TSC1缺失引起的表型是通过mTOR信号介导的，因为特异性mTOR抑制剂Torin1消除了sgTSC1诱导的球状体大小增加(图S3H和S3I)。这些结果表明，在3D培养中，仅在NRF2信号完整的情况下，mTOR信号通路的激活可增强细胞增殖；此外，虽然TSC1的缺失增加了球状体的大小，但并没有增加NRF2缺失细胞中球状体内部细胞的存活(图S3F和S3G)，这表明增强癌细胞的增殖并不足以促进球状体内部细胞的存活。
A549和H1437细胞中最显著的失活是GPX4，它通过将脂质氢过氧化物转化为无毒脂质醇，对一种称为铁蛋白作用的非凋亡细胞死亡具有保护作用。鉴于我们之前的研究表明，ROS水平在癌症球状体的内核升高，这些结果暗示了内基质缺失细胞易受ROS依赖性铁螯合现象影响。
在球状体形成后，A549、H1437和H520细胞中，我们用两种GPX4抑制剂ML210或RSL3处理的球状体显示内腔细胞存活率下降(图5A、5B和S4A-S4D)。Ferrostatin-1 (Fer-1)是一种有效的选择性铁死亡抑制剂，消除了RSL3处理的球状细胞内部清除(图S4C和S4D)，暗示内球形细胞易受铁死亡的影响(图S4C和S4D)。这一观点得到亚油酸处理的验证，亚油酸是u6多不饱和脂肪酸含磷脂(PUFAPLs)的前体，是脂质过氧化反应的底物，诱导A549和H1437球体内细胞的清除(图S4E和S4F)。这些结果表明球形细胞中NRF2的下调导致清除增加，并暗示铁死亡是球形细胞内部清除的细胞死亡机制。
图5 NRF2通过保护内球形细胞免受铁死亡而控制细胞存活
(A)三个独立实验所示椭球体的代表性共焦图像。(B) (A)中所述实验的填充内部空间的百分比(n = 35-77)。(C)三个独立实验所示椭球体的代表性共焦图像。(D) (C) (A549)和图S4G (H1437)中描述的实验中填充的内部空间百分比(n = 11-77)。(E)三个独立实验中所示椭球体的代表性共焦图像。(F)从(E)描述的实验中定量球形尺寸(n = 18 112)。(G)使用(E)中描述的实验中用shControl定量Ki67信号相对于Fer-1未处理球体 (n = 4-24)。(H)在三个独立实验中指出第10天球中的H2O2水平(任意单位)。(I)来自两个独立实验的第10天A549椭球的C11-BODIPY比率代表图像。(J)定量(I)中描述的实验中内部区域相对于外部区域的C11-BODIPY比率(n = 12-20)。(K) 3个独立实验所示第10天球状体的Fe2+水平。(L) H1437球状体中NRF2和ACSL4的免疫印迹分析。
6. NRF2通过对铁死亡的保护来调节基质内缺失细胞的存活
为了解决与NRF2敲除相关的球状体内部清除是否由铁死亡介导，我们培养了存在Fer-1的A549和H1437球状体。Fer-1处理可抑制NRF2敲除的球状体内部清除(图5C、5D和S4G)，表明NRF2通过保护细胞免受铁死亡作用而调节细胞内部存活。用Fer-1处理球状体并不能挽救球状体大小和Ki67染色(图5E-5G)，这表明NRF2介导的增殖调节并不涉及对铁死亡的保护。
ROS和u6 PUFA-PLs是脂质过氧化反应的底物。NRF2敲除增加了过氧化氢(H2O2)在A549和H1437球状体的水平(图5H)，表明NRF2通过降低细胞ROS水平抑制脂质过氧化，而NRF2敲除和ML210处理显著增加了球状体核心的脂质过氧化物水平，这是由比例脂质过氧化探针C11-boron-dipyrromethene (BODIPY)测定的(图5I, 5J, S4H,S4I)，表明内球体细胞易发生脂质过氧化反应，NRF2调节球体的脂质过氧化反应。NRF2的下调并没有增加细胞内Fe2+的水平，Fe2+可以通过Fenton反应产生羟基自由基，并促进铁死亡，或者ACSL4的表达，ACSL4是一种负责u6 PUFA-PL生成的酶(图5K和5L)，表明NRF2下调的细胞对铁死亡敏感性增加并不是由于Fe2+或ACSL4所致。这些结果支持了我们的观察，即NRF2通过抗氧化依赖途径调节球形细胞内的存活。
接下来我们研究了NRF2和GPX4之间的关系。鉴于之前的文章已经暗示了NRF2诱导GPX4表达，我们研究了NRF2下调细胞中的GPX4水平。令人惊讶的是，在2D和3D培养条件下，NRF2的下调显著提高了GPX4的水平(图6A和6B)。而一种可能的解释是NRF2下调引起的氧化应激增强可激活其他细胞保护程序，如上调抗氧化酶转录的核因子kB (NF-kB)；然而，NRF2敲低并没有增加GPX4 mRNA的水平(图S5A)，而在A549和H1437细胞中，相对稳定的烷基氢过氧化物叔丁基过氧化氢(TBHP)或GPX4抑制剂ML210处理诱导的氧化应激并没有提高GPX4蛋白的水平(图S5B)；此外，抗氧化剂NAC或Trolox处理并不能消除NRF2敲低诱导的A549和H1437细胞GPX4表达的增强(图S5C)。NAC处理虽然抑制了shNRF2处理的H1437细胞中GPX4的表达，但其表达水平仍高于shControl处理的H1437细胞，而Trolox并没有降低shNRF2处理的H1437细胞中GPX4的表达。这些数据表明，NRF2敲除并不能诱导GPX4 mRNA的表达，氧化应激的增强并不足以稳定GPX4蛋白。
GPX4是一种含硒蛋白，含有硒半胱氨酸(Sec)，第21个氨基酸。因此，NRF2下调后GPX4蛋白的诱导可能是硒蛋白翻译的改变，但癌症依赖图的分析数据显示，GPX4的前五个共同依赖性基因是Sec生物合成所需的基因(图S5D)。为了找出是否所有硒蛋白或仅是GPX4的翻译受到NRF2下调的影响，我们使用了等压串联质量标签(TMT)标记结合液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)分析(图6C)。在蛋白质组学数据(图S5E;表S5)中，25种人体硒蛋白中有11种被检测到(表S6)，而且令人惊讶的是，大多数检测到的硒蛋白在NRF2下调后表达增加(图6D、6E和S5F)，这表明NRF2敲低后GPX4的诱导并不是针对该硒蛋白；相反，大多数硒蛋白受全球调节硒蛋白生物合成的影响。此外，通过蛋白质组学检测到与GPX4相互依赖(图S5D)的3个硒蛋白生物合成基因(表S6)中，只有本身是硒蛋白的SEPHS2在NRF2下调后发生了改变(增加)，相比之下，NRF2真正的靶基因TXNRD1在NRF2敲除后显著降低，尽管TXNRD1也是一种硒蛋白(图6E、S5F和S5G)。考虑到TXNRD1非常丰富，比其他可检测到的硒蛋白高几个数量级(图6E和S5F)，NRF2敲除细胞中TXNRD1蛋白水平的降低可释放大量的Sec库，这些Sec库可以被并入其他硒蛋白，从而导致硒蛋白的表达增加。事实上，亚硒酸钠处理增加了shControl和shNRF2细胞中GPX4蛋白的表达(图S5G)，表明硒的可用性是GPX4表达的一个关键因素，但是补充硒并没有诱导TXNRD1的表达，这可能是由于硒的充足诱导了携带硒半胱氨酸5-甲氧基羰基甲基-20- O甲基尿苷(mcm5Um) tRNA[Ser]Sec的甲基化亚型上调。由于未甲基化的5-甲氧基羰基甲基尿苷(mcm5Um)异型特异性地结合到TXNRD1中，而两者都结合到GPX4中，因此无法预测TXNRD1的增加；也有研究表明，TXNRD1蛋白的表达水平不受硒可用性的影响，是由于半胱氨酸可以在缺硒条件下替代TXNRD1中的Sec。
图6 下调NRF2可诱导包括GPX4在内硒蛋白的全面富集
(A和B)对所示细胞中的NRF2和GPX4进行免疫印迹分析。(C)蛋白质组学方法示意图。(D)在用shControl或shNRF2-#2转染的A549细胞中，蛋白质组学检测到的有含硒蛋白或含硒蛋白生物合成所需的蛋白。(E) A549细胞中检测到所有硒蛋白的强度。
7. 靶向NRF2和GPX4可导致肺癌球形细胞大量死亡
球体内部细胞表现出更高水平的脂质过氧化和我们观察到增加GPX4差别NRF2对这些基因的表达,可能是细胞内外氧化应激能力差或球状体的外层细胞能够适应增加氧化应激反应减少NRF2或GPX4，而ML210联合NRF2下调处理球状体会导致内外细胞死亡(图7A和7B)。
接下来，我们研究了NRF2的降低和GPX4活性的抑制在3D培养中是否具有特异性杀伤作用，或者这种联合作用在2D培养条件下是否对细胞也具有杀伤作用。在2D培养条件下，A549细胞即使在没有遗传操作的情况下也对ML210敏感，而H1437、H520和SK-MS-1细胞敏感性较低或不敏感(图7C)，这可能是由于KRAS突变状态的差异决定的，因为ML210等铁死亡诱导剂对RAS突变的肿瘤细胞和间充质细胞具有选择性致死作用；A549细胞有KRAS激活突变，而其他细胞含有野生型KRAS。在2D培养中，NRF2的下调使A549、H1437、H520和SK-MS-1细胞对ML210轻度致敏(图7C)；在3D培养中，shNRF2的诱导使细胞对ML210更敏感(图7C和S6A)；在2D和3D培养条件下，与Fer-1共处理可完全恢复对ML210的敏感性(图7D和7E)。KEAP1基因敲除增强了ML210处理的H596细胞中球状体的存活，该细胞系显示出中间NRF2评分(图2D)，而ML210诱导了sgKEAP1处理的H596球状体的内部清除(图S6B S6E)。这证实了NRF2在NRF2过度激活的肺癌细胞系中的作用。
在shControl和shNRF2的球状体中，硒的补充并不影响内细胞的存活和增殖，但降低了对ML210的敏感性(图S6F - S6K)；然而，即使在补充硒后，NRF2敲低仍然使球状细胞对ML210显著敏感(图S6K)，这表明NRF2的沉默使球状细胞极易受到铁死亡的影响，即使GPX4表达上调。
接下来，我们评估了NRF2和GPX4联合缺失是否会加剧脂质过氧化，从而增强细胞死亡(图7F和7G)，其中，细胞被处理的ML210量是以前的十分之一，以避免细胞总数死亡。在shGFP转染的对照A549球状体中，ML210处理特异性地增加了球体内部区域的脂质过氧化。在NRF2敲除的A549球状体中，ML210处理增加了球状体内部和外部区域的脂质过氧化，尽管在球状体内部区域的诱导比外部区域更明显。但用ML210处理NRF2敲除球体的外区脂质过氧化水平与不用ML210处理shNRF2转染球体和用ML210处理shGFP转染球体的内区脂质过氧化水平相当(图7G)。不用ML210处理shNRF2转染球体和用ML210处理shGFP转染球体表现出内部清除。考虑到这些结果，用ML210处理NRF2敲除球体的外区脂质过氧化水平可能高于脂质过氧化的阈值，从而导致铁死亡。因此，多重氧化应激防御程序的联合靶向是有效杀死肿瘤细胞所必需的。
图7 NRF2的缺失和GPX4的抑制共同导致球体内外细胞的死亡
(A和B)三个独立实验所示椭球体的代表性共焦图像。(C-E)与ML210未处理的对照组相比，在过去3天内ML210处理的指示细胞中细胞/球体总面积。(F) 在过去3天内，在两个独立实验使用1mM ML210处理后的第10天A549球状体的C11-BODIPY比率图像。(G) 在过去3天内用或不用1 mMML210处理的A549球的C11-BODIPY比率的定量。
结论
我们的研究结果对癌症治疗有几个重要的意义。首先我们的研究为使用3D培养模型识别在常规2D检测中可能被掩盖的治疗靶点提供了进一步支持，此外，我们的发现为靶向细胞的抗氧化能力作为癌症治疗策略提供深入的证据；更重要的是，我们观察到内细胞和外细胞对铁死亡的敏感性不同，这表明肿瘤的不同区域可能具有不同的氧化应激能力和对铁死亡的敏感性，因此，针对多种氧化应激防御程序可能需要最大限度地杀死肿瘤中的所有细胞。在这种情况下，其中一种治疗策略可能是通过直接靶向NRF2、直接靶向GPX4、靶向铁死亡的NRF2转录靶点(如SLC7A11)或其他影响脂质过氧化敏感性的途径(如ACSL4)来诱导铁死亡。本研究为开发以抗铁中毒调节剂靶点的化合物提供了一种有价值的方法，在联合治疗中可能特别有效，类似于联合治疗策略，包括抗凋亡蛋白抑制剂，目前正在临床试验中进行测试。