编译：微科盟彭翰林，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。
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导读
肿瘤缺氧会对治疗结果产生负面影响，也是目前临床上尚未解决的问题。硝基咪唑是低氧选择性化合物，通过形成药物-蛋白质加合物而被困在缺氧细胞中。它们被广泛用作缺氧诊断剂，也显示出了针对缺氧的治疗方法的前景。然而，关于硝基咪唑的蛋白质靶标及其修饰对癌细胞的影响知之甚少。在本篇文章中，我们报告了N3-AZA的合成和应用，这是一种新型的点击化学兼容的2-硝基咪唑，旨在促进基于LC-MS/MS的蛋白质组学分析头颈部癌细胞中2-硝基咪唑靶向的蛋白质，以及快速有效地标记缺氧细胞和组织。生物信息学分析表明，我们确定的62种靶蛋白中有许多蛋白参与关键的经典途径，包括糖酵解和HIF1A信号传导，这些信号通路在细胞对缺氧的应答中起关键作用。关键的细胞蛋白，例如GAPDH和GSTP1表现出众，而N3-AZA加合物的形成仅在低氧条件下才显著降低其酶活性。因此，本文报道的GAPDH，GSTP1和其他蛋白质可能代表了进一步提高基于硝基咪唑的癌症治疗潜能的候选靶点。
原名：Identification of proteins and cellular pathways targeted by 2-nitroimidazole hypoxic cytotoxins译名：鉴定2-硝基咪唑低氧细胞毒素靶向的蛋白质和细胞途径通讯作者：Piyush Kumar；Michael Weinfeld
图1A描绘了由两种前体即Ts-AZA和IAZA合成目标化合物N3-AZA的过程。由于后一种途径提供了更好的扩展性并且没有可检测的副产物，因此反应以数克规模进行，产率为93％。N3-AZA溶于DMSO，在-20℃储存数月仍可保持活性。
图1 N3-AZA的合成，细胞毒性和用于分离2-NI目标蛋白点击化学原理（A）N3-AZA的合成。N3-AZA在低氧FaDu（B），A549（C），A172（D）和PC3（E）细胞中显示出优先的细胞毒性，其常氧和低氧IC50值在统计学上有显著差异。（F）用于分离和可视化N3-AZA结合的蛋白的实验设计。（G）使用生物素炔对从N3-AZA处理的常氧和低氧FaDu细胞收集的细胞提取物进行点击化学。我们首先验证了N3-AZA的低氧选择性，以确定可限制该化合物的用途。结晶紫染色测定法用于确定在常氧和低氧条件下药物的细胞毒性。在四个测试的人类癌细胞系中，在缺氧条件下，N3-AZA的毒性要比常氧性更高（图1B–E）。我们直接比较了FaDu细胞中N3-AZA的细胞毒性与吡莫硝唑的细胞毒性。对于N3-AZA，低氧FaDu细胞的IC50值比常氧下的IC50值低5倍。重要的是，即使在缺氧条件下，该化合物在浓度≤100μM时也几乎没有毒性（图1B）。在低氧细胞中，活化的（生物还原的）2-NI与细胞蛋白结合并形成药物-蛋白加合物。为了鉴定这些蛋白质靶标，我们用N3-AZA处理常氧和低氧FaDu细胞，进行裂解后用生物素标记的炔烃对蛋白质裂解物进行点击化学反应。我们处理“点击”的裂解物以进行蛋白质印迹，并使用辣根过氧化物酶偶联的链霉亲和素进行探测，结果表明“点击”的蛋白仅存在于N3-AZA处理的低氧细胞中；然后我们用抗生蛋白链菌素-突变蛋白珠成功分离出这些蛋白（图1F）。免疫印迹证实了非生物素化蛋白与色谱柱基质的低背景结合（图1G）。我们通过质谱鉴定回收的蛋白，并进行生物信息学分析以进行功能表征。在三个独立实验获得的洗脱液的蛋白质组学数据集中，我们总共鉴定出65种蛋白质，而在“低氧+N3-AZA”洗脱液中仅鉴定出48种蛋白质（图2A）。在用N3-AZA处理的细胞中鉴定出的所有蛋白我们用相应的平均PSM分数标注（图2B），经N3-AZA处理的低氧细胞的粗提液和洗脱液之间的富集分析表明，大多数高丰度蛋白都与药物反应。但是，几种高度丰富的蛋白也逃脱了N3-AZA的标记（例如， ACAD9）。同样，一些相对低丰度的蛋白，如铁蛋白重链，桥粒铂和钙抑素也很容易被N3-AZA修饰（图2C）。已知活化的2-NI化合物会攻击细胞亲核试剂以形成加合物，半胱氨酸（Cys）经常被提议作为对蛋白质的攻击位点。因此，我们分析了N3-AZA靶蛋白序列以评估与其Cys含量的任何关联，结果发现，在这些蛋白中，有5个没有任何Cys残基，而有34个蛋白具有1-5Cys，17个具有6-10 Cys，3个具有11-15 Cys，只有3个蛋白具有> 20 Cys残基。这促使对次亲核氨基酸脯氨酸（Pro）的数据进行分析。有趣的是，N3-AZA靶蛋白中除一个（TPM3）外，其余都含有脯氨酸残基，其中几乎60％含有> 15 Pro残基。但TPM3包含1个Cys残基。我们使用PANTHER分类系统（细胞成分，分子功能和生物学过程）对N3-AZA的62种假定靶蛋白进行了分类。细胞成分分析表明，N3-AZA靶蛋白主要是细胞质的（62种蛋白中有44种；约71％），其次是13种核蛋白（约21％），4种质膜蛋白和1种带注释的细胞外基质定位。根据分子功能，大多数蛋白属于结合，催化活性和结构活性的子类别。与生物过程有关的蛋白质主要属于细胞过程，代谢过程，定位，生物调节和对刺激反应的亚类。我们还对数据集进行了分析，以评估这些靶蛋白是否在常见的上游调节子的调节下。此处报告了与低氧反应有关的两个簇：（i）HSF1调控的簇1（8种蛋白质）（图2D）和（ii）HIF1A调控的簇2（8种蛋白质）（图2E）。
（A）维恩图显示了基于不同处理条件通过质谱分析鉴定的蛋白质的分布。（B）比较N3-AZA处理的高氧和低氧细胞洗脱液中鉴定出的蛋白质的PSM值。（C）富集分析表明，N3-AZA标记的可能性通常取决于目标蛋白的丰度。（D和E）通过IPA进行的上游调节分析确定了2个簇。4. N3-AZA处理不会影响目标蛋白的水平和定位，但会降低缺氧条件下的GAPDH和GSTP1酶活性为了评估N3-AZA处理对其靶蛋白的影响，我们研究了以下蛋白：肌动蛋白，微管蛋白，热休克蛋白90（Hsp-90），GAPDH和GSTP1；而HIF1A用作成功诱导缺氧的指标。我们用250μM N3-AZA处理的低氧细胞显得更致密，但是靶蛋白水平或细胞定位均未观察到显著差异（图3A和B）；为了检查N3-AZA处理是否影响GAPDH的酶活性，我们测量了生成的NADH量作为GAPDH的活性。我们使用接近低氧IC50值的N3-AZA的浓度（250μM）进行处理，发现GAPDH酶活性仅在低氧条件下显著降低；我们在常氧下未观察到对GAPDH活性的影响（图3C）。而通过检测GST活性，我们发现尽管低氧暴露显著增加了对照组细胞中的GST活性，但用N3-AZA处理过的低氧细胞显示出显著的剂量依赖性GST活性降低（图3D）。
图3 N3-AZA对GAPDH和GSTP1蛋白水平，GAPDH定位及其酶活性的影响（A）处理由N3-AZA处理的常氧和低氧FaDu细胞制备的裂解物以进行Western印迹。（B）在常氧和低氧下用N3-AZA处理的细胞进行免疫细胞化学处理，以监测GAPDH的定位。在常氧和低氧下用N3-AZA处理的FaDu细胞进行GAPDH活性测定（C）或GST活性测定（D）。N3-AZA的叠氮基部分与荧光团偶联的炔烃之间的点击化学作用使我们可以使用荧光显微镜对缺氧下形成的N3-AZA加合物的亚细胞定位进行成像。我们用N3-AZA处理6小时后，仅在缺氧的细胞中观察到荧光染色（图4A–D）。此外，该化合物以逆氧气依赖性的方式截留在FaDu细胞中，在<0.1％O2下培养的细胞中具有最高的保留率；常氧细胞显示极少或几乎没有点击染色；低氧条件下N3-AZA的染色呈剂量依赖性，其中100μM的浓度表现出最明显的差异（图4D）；在其他癌细胞系中也证实了类似的低氧选择性N3-AZA染色模式。为了评估复氧后N3-AZA蛋白加合物的代谢稳定性，我们将FaDu细胞在缺氧条件下用100μM N3-AZA处理6 h，然后复氧，在指定的时间点固定并进行N3-AZA点击染色；在整个复氧期间，N3-AZA存在于培养基中。N3-AZA点击荧光信号可在重新复氧后长达24小时后被检测到，这表明N3-AZA修饰相对稳定。为了证实N3-AZA点击染色的低氧选择性，我们同时用pimonidazole和N3-AZA处理的细胞进行吡莫尼唑免疫染色，然后对N3-AZA组进行点击化学处理，结果我们仅在经过药物处理的低氧细胞中检测到N3-AZA点击染色和吡莫尼唑免疫染色，而发现在高氧样品中的信号极少（图5A）。两种染色策略在区分常氧和低氧细胞方面同样有效，但是，与吡莫硝唑免疫染色相比，N3-AZA点击染色被证明更简单，更快速，并且产生了更好的信噪比（图5B）。有趣的是，尽管两种化合物都包含2-NI部分，但它们显示出明显不同的细胞染色模式。N3-AZA在缺氧细胞中产生了强烈的核仁信号，而吡莫硝唑染色被排除在核仁之外。
（A–D）在常氧或低氧下孵育用不同浓度的N3-AZA处理的FaDu细胞，并使用带有荧光标记的炔烃对低聚甲醛固定的细胞进行点击化学反应。N3-AZA点击染色仅存在于经过药物处理的低氧细胞中。（E）N3-AZA点击染色集中在核仁中。由于N3-AZA点击化学可有效染色低氧细胞，因此与吡莫硝唑相比，其检测肿瘤组织中低氧区域的能力得到了检验。我们最初使用的是FaDu细胞皮下异种移植模型，先前已证明该模型的缺氧率为11–12％。由点击化学反应定义的肿瘤缺氧区域存在于与坏死接壤的区域中，并且与脉管系统无关（图5C）。吡莫硝唑免疫染色产生了相似的染色模式（图5D），如预期的那样，吡莫硝唑和N3-AZA染色共定位于与坏死区域相邻的区域（图5E），这些发现随后在小鼠原发性头颈部肿瘤中得到了验证（图5F）。对于这两种肿瘤模型，我们观察到用于吡莫尼唑和CD31的二抗对肿瘤切片的非特异性染色水平均较低；而N3-AZA点击染色可提供更清晰的背景。我们进一步量化了不同体积肿瘤中的低氧分数，以确定肿瘤大小与低氧之间是否存在关系。我们的数据没有显示出大小依赖性，这意味着小肿瘤可能会对治疗有抵抗力。
（A）来自三个独立实验的代表性显微照片，显示在用两种化合物共同处理的低氧FaDu细胞中，N3-AZA点击染色和吡莫尼唑免疫染色重叠。（B）用IMARIS软件处理显微照片，以量化N3-AZA点击染色和pimonidazole免疫染色的通道强度。（C–F）体内比较N3-AZA点击染色与吡莫硝唑免疫染色。癌细胞的快速生长，加上混乱的肿瘤脉管系统，在肿瘤内形成了一些被剥夺了营养和氧气的区域。临床上称这种现象为“肿瘤缺氧”，几乎在所有实体恶性肿瘤中都有报道。这些低氧环境中的细胞上调了无数的生存前适应性反应，包括药物传递受损，癌基因激活，细胞代谢异常和DNA损伤检查点信号失控。此外，低氧会刺激肿瘤转移，侵袭和复发，并维持肿瘤细胞的生长。最重要的是，低氧癌细胞对放射线，化学疗法和免疫疗法具有抵抗力，导致患者预后不良。尽管这使对缺氧定向治疗的需求合理化，但它尚未成为常规临床实践的一部分。硝基咪唑（NIs）是一类低氧激活的前药，它们以反O2依赖性方式被生物还原激活。该过程涉及通过硝基还原酶还原，生成硝基自由基阴离子。该中间体会在O2存在的情况下被重新氧化，从而使药物从充氧良好的细胞中自由扩散出来。在缺氧条件下，硝基自由基阴离子发生还原性衰变，从而产生反应性羟胺，其与细胞大分子共价结合，导致药物的低氧选择性积聚。这种特性使NIs成为靶向低氧肿瘤细胞的理想选择。然而，尽管显示出希望，但一些NIs在临床试验中失败了。这些令人失望的结果可能部分归因于我们对NIs精确分子机制的有限理解。确实，从未探讨过人类癌症中NIs的蛋白质靶标，因此很难理解其对靶标蛋白质的影响。在这里，我们概述了使用新型点击化学兼容的2-NI试剂N3-AZA来标记和分离NI目标蛋白的策略。然后使用液相色谱偶联质谱法（LC-MS/MS）对蛋白质进行表征。生物信息学分析表明，这些蛋白质中的许多蛋白质在细胞对缺氧的反应中起关键作用。N3-AZA点击反应的模块性质也支持其作为出色的缺氧标记物。2-NIs在放射成像和基于免疫的检测中广泛用作缺氧诊断。正电子发射断层扫描（PET）使用放射性标记的2-NI进行扫描，例如18F-FMISO或18F-FAZA，可对肿瘤缺氧进行无创性功能成像。当前用于检查评估肿瘤缺氧以及免疫化学检测组织中药物-蛋白质加合物涉及使用2-NI化合物，例如吡莫尼唑（Hypoxyprobe™）和EF5。相反，N3-AZA通过使用荧光标记的炔烃可视化缺氧组织，提供了一种独立于抗体的替代方法。肿瘤微环境由于其在治疗结果中的作用而在最近获得了相当大的关注；但是，针对低氧肿瘤的策略很少能取得成功的结果。尽管遭受了几次挫折，但NIs作为低氧治疗药物仍具有重要价值，例如，尼莫拉唑（5-NI）与放疗相结合，在治疗晚期头颈癌患者中起到了一定的作用。有趣的是，对NI临床试验的荟萃分析显示，患者的预后总体改善，尤其是根据肿瘤的氧合状态进行分层时，因此，深入了解NI分子机制对于更好地指导基于NI的癌症治疗方法的未来发展至关重要。长期以来，NIs都与低氧细胞中的核酸和蛋白质结合。虽然早期的NI研究几乎完全集中在其诱发DNA损伤的潜力上，但NI蛋白的靶标仍不明确，确实存在一些蛋白质组学研究，尽管主要限于原生动物中5-NIs的反应。最近，有文献概述了一种基于点击化学的方法，该方法使用修饰的甲硝唑和叠氮基生物素在贾第鞭毛虫中鉴定候选5-NI药物靶标。目前的研究表明，具有生物素炔的N3-AZA点击化学与基于哺乳动物细胞的测定法兼容，可以有效地生物素化在缺氧条件下与2-NIs相互作用的蛋白质（图1G），然后我们分离这些蛋白质，通过质谱鉴定，表征靶向缺氧的分子的功能。我们发现N3-AZA共有62个蛋白质靶标，其中48个在我们的对照样品中不存在（图2A，表1）。与先前报道的硫醇基团是NI攻击的主要部位的报道相反，蛋白质的Cys含量高低与N3-AZA结合的可能性之间并没有明确的关联。尽管此观察结果可能是由于Cys残基被埋在蛋白质结构内或形成了半胱氨酸-半胱氨酸二硫键，但也可能暗示其他亲核氨基酸（例如Pro）充当NI化合物加合物形成的位点。实际上，当前的分析表明，大多数N3-AZA靶蛋白富含Pro残基。不幸的是，如果没有N3-AZA-氨基酸衍生物的确切化学式，我们将无法通过MS鉴定潜在的结合物。
表1 使用LC-MS / MS在N3-AZA处理的低氧细胞的洗脱液中鉴定出的蛋白质
我们使用几个生物信息学平台对蛋白质组数据进行分析。N3-AZA靶蛋白以胞质为主(~71%)，核蛋白仅占~21%。我们通过IPA进行的上游调控分析确定了两个与缺氧反应有直接关系的调控簇。簇1(受HSF1调控)有8个下游靶点，其中5个是直接参与低氧适应和保护复氧诱导的氧化应激的分子伴侣(HSP90AA1，HSP90AB1，HSPA1A,HSPA8和HSPD1)。我们特别感兴趣的是簇2，它由8个受HIF1a调控的N3-AZA靶蛋白组成。HIF1a被称为缺氧的主要调节因子，在细胞对缺氧的反应中起着关键作用。缺氧诱导HIF1a的表达导致促生存基因的上调，包括那些与葡萄糖代谢有关的基因。在第2簇的8个N3-AZA靶蛋白中，有7个与碳水化合物代谢有关。N3-AZA(和其他2-硝基咪唑类化合物)与这些下游靶点的结合是否能抵消HIF1a的作用还有待研究。有趣的是，在我们的62种靶蛋白清单中（表1），途径分析将糖酵解I列为最重要的通路之一；N3-AZA靶蛋白中有五个属于该途径（ALDOA，ENO1，GAPDH，PKM和TPI1），并受HIF1A调控（表2，图2E）。值得注意的是，通过糖酵解的上调来重新编程葡萄糖代谢是肿瘤发生的关键标志。尽管效率不如线粒体呼吸系统，但癌细胞还是容易利用有氧糖酵解来产生ATP，主要是为了抵消线粒体缺陷或补偿缺氧条件下的线粒体氧化磷酸化缺陷。糖酵解的增加还通过增加乳酸的产生提供了酸性的微环境，从而促进了恶性进展。GAPDH被确定为N3-AZA的最高目标，平均PSM得分为18.3。据报道，GAPDH转录以HIF1A依赖性方式在缺氧细胞中被上调，但是，这种调节似乎是细胞类型特异性的。除了在糖酵解中的作用外，GAPDH还涉及多种生理和病理生理过程，这使GAPDH成为值得关注的后续目标。我们后续探讨了N3-AZA处理影响GAPDH的三个方面：总蛋白水平，细胞分布和酶活性。在常氧和低氧条件下，总的GAPDH蛋白水不受N3-AZA处理的影响。NIs（例如PA-824）可以通过充当NO供体来诱导亚硝化应激，这可能导致GAPDH氧化/ S-亚硝基化及其向核的转运。免疫细胞化学分析显示，N3-AZA处理不会改变GAPDH细胞分布（图3B）。在常氧治疗组之间，GAPDH活性没有显著差异，而在低氧孵育后，与对照组对照相比，在用250μM N3-AZA处理的细胞中，其酶促活性降低了> 30％（图3C）。
我们分析了另一个关键蛋白靶标GSTP1（表1）。GSTP1参与了丝裂原激活的蛋白质（MAP）激酶途径：蛋白质与c-Jun N末端激酶1（JNK1）和凋亡信号调节激酶（ASK1）的相互作用。尽管GST可以通过保护细胞蛋白和DNA免受内源性反应性化合物的侵害来防止肿瘤形成，但它们的解毒特性可能有助于肿瘤细胞的多重耐药性。肿瘤通常表达高水平的GST（尤其是GSTP1），并且GST在多药耐药细胞中经常过表达。另外，低氧暴露通常伴随着GST活性的增加，以应对改变的细胞内氧化还原电位和增加的细胞活性氧（ROS）的产生。以前曾有文章报道过硝苯并咪唑类药物，如乙胺达唑和米索尼唑可抑制GST活性。我们的分析与这些发现一致，并且表明仅在N3-AZA处理的低氧细胞中GST活性显著降低。该药物的抑制作用似乎不是由于蛋白水解引起的，因为未观察到响应药物治疗或低氧暴露而导致GSTP1蛋白水平发生变化（图3A）。NI靶向蛋白列表中还有过氧化物酶1（Prdx1）（表1）。Prdx1活性位点包含两个Cys残基，这对于其催化功能至关重要，并且可以作为硫醇反应性NIs的潜在结合位点，因此，很容易推测N3-AZA通过其催化的Cys残基与Prdx1结合然后对其酶活性产生负面影响。Prdx1在细胞排毒中起到分子伴侣的作用，具有抗凋亡特性，在癌症中被上调，并有助于放射抵抗。有趣的是，Prdx1在缺氧条件下可能被上调，以抵消缺氧/复氧介导的活性氧积累的有害作用，并为恶性进展提供积极的生存优势。因此，N3-AZA结合和随后的Prdx1酶活性降低可能为其缺氧细胞毒性提供了另一种机制，但需要进一步的研究来检验这个假设。N3-AZA点击化学的独特之处在于它的多功能性，因为它也可以用作缺氧标记物。N3-AZA与18F-FAZA具有结构同源性，与其他2-NI低氧放射性示踪剂相比，N3-AZA本身具有优越性。N3-AZA点击化学可通过利用Cu（I）催化的点击化学来可视化细胞缺氧，从而提供一种更简单的替代方法。尽管N3-AZA的2-NI部分可确保其在低氧细胞中选择性形成药物-蛋白质加合物，但在Cu（I）存在的情况下，可以利用叠氮基团的炔烃分子对这些加合物进行荧光标记，而使用炔烃结合的NI(SN33267)对缺氧细胞进行荧光标记的类似策略此前已在一项专利和一项MSc论文中报道过。N3-AZA点击荧光对缺氧细胞具有极高的选择性，在正常缺氧细胞中背景染色最少。它显著缩短了染色时间(30分钟，而匹莫硝唑为2.5小时)，同时仍保持了高保真度。据报道，O2水平和N3-AZA点击染色强度之间存在反向关系(图4A-D)。N3-AZA显示细胞核优先摄取N3-AZA，集中在核仁中(图4e)。虽然这并不一定与蛋白质组学分析相一致(N3-AZA靶蛋白主要是细胞质的)，部分核N3-AZA点击染色可能归因于药物-核酸加合物的形成。这里没有研究N3-AZA-核酸结合，然而，以前的研究报道了活化的NIS与DNA的直接结合。N3-AZA和匹莫硝唑在FaDu细胞中表现出相似的细胞毒性模式。匹莫硝唑免疫染色和N3-AZA点击化学都能有效地标记缺氧细胞，然而，后者明显更快，并产生更清晰的背景(图5A和B)。N3-AZA和匹莫硝唑作为缺氧探针的效率也在体内进行了比较，使用了两种头颈部癌小鼠模型：(I)基于FaDu细胞的皮下肿瘤模型(图5C-E)和(Ii)基于Cre-loxP的HPV阴性鳞癌原代小鼠模型(图5F)。在肿瘤切片中，N3-AZA-和匹莫硝唑染色的区域重叠，表明N3-AZA点击化学染色与匹莫硝唑免疫染色认为缺氧的区域相同(图5e)。不出所料，N3-AZA和匹莫硝唑染色的区域大多与血管系统互斥(CD31阳性区域)。此外，在给予N3-AZA的荷瘤小鼠的器官(脑、肺、肝、肾和颈部淋巴结)中也没有检测到明显的点击染色，这表明N3-AZA优先积聚在肿瘤的缺氧区。一个重要的临床问题是，肿瘤大小在多大程度上决定了缺氧水平？先前由计算机化的Eppendorf pO2组织成像获得的数据表明，缺氧与肿瘤大小无关。我们对体积在150到350mm3之间的肿瘤进行N3-AZA点击染色的数据也表明，肿瘤大小和缺氧水平之间没有明显的关联(图1)。总而言之，N3-AZA点击化学提供了一种可靠的化学策略，可在人的头颈部肿瘤模型中识别2-NI化合物的潜在蛋白质靶标。N3-AZA与糖酵解酶GAPDH和解毒酶GSTP1的结合仅在低氧条件下才显示对其酶活性的影响，这不仅为进一步研究NI化合物的机理开辟了一条有趣的途径，而且还表明了它们在靶向NI化合物中的潜在作用。另外，N3-AZA点击反应的模块性使其可作为抗体独立的组织学缺氧标记物应用，它提供了比吡莫硝唑免疫染色更快但同样有效的替代方法。https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33640700/
