科研 | CELL：疾病相关SHP2突变体的相分离是MAPK过度活化的基础（国人佳作）
编译：小北，编辑：景行、江舜尧。
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非受体蛋白酪氨酸磷酸酶（PTP）SHP2是由PTPN11编码的，在正常发育RAS-有丝分裂原-活化的蛋白激酶（MAPK）信号通路中发挥重要的作用。令人费解的是PTPN11酶活化和失活的突变体为什么能够导致具有重叠临床表现的人类发育紊乱。在本研究中，研究者发现一种常见的、在这些疾病相关的SHP2突变体中共有的液-液相分离(LLPS)行为。SHP2 LLPS是由保守的、折叠良好的PTP结构域通过多价电子相互作用介导，并且通过构象的改变由一种内在的自体抑制机制调节。SHP2变构抑制剂能够减弱SHP2突变体的LLPS，提高SHP2 PTP的活性。此外，疾病相关SHP2突变体能够招募和激活LLPS中的WT SHP2，促进MAPK的活化。这些结果不仅暗示LLPS以一种功能获得的方式参与SHP2相关人类疾病的发病机制，也提供证据说明PTP受LLPS调节，LLPS可能作为治疗的靶向。
论文ID
原名：Phase Separation of Disease-Associated SHP2 Mutants Underlies MAPK Hyperactivation
译名：疾病相关SHP2突变体的相分离是MAPK过度活化的基础
期刊：Cell
IF：38.637
发表时间：2020年9月
通讯作者：刘聪
通讯作者单位：中国科学院上海有机化学研究所
DOI号：10.1016/j.cell.2020.09.002.
实验设计
结果
为了探究疾病相关突变体如何影响SHP2细胞内的功能，研究者在KYSE520细胞中稳定表达了6个mEGFP标记的SHP2突变体 (1个WT, 3个NS/JMML突变体,以及2个NS-ML突变体)，该细胞系是一种依赖SHP2的食道癌细胞系。SHP2-mEGFP的表达水平与内源性SHP2具有可比性。重要的是，活细胞荧光显微镜发现所有与疾病相关的SHP2突变体都形成了离散的斑点，而SHP2 WT在整个细胞中明显散布（图1A）。高内涵成像分析显示疾病相关SHP2突变体不仅在数量上，在斑点的平均大小上也超过了SHP2WT（图1B）。在SHP2突变体中斑点的数量与平均斑点大小相关。此外，在一些其他细胞系中，包括HEK293T, A549,以及HUVEC，利用mEGFP-或者mScarlet-标记的SHP2进行的实验中也观察到相似的突变体特异的斑点形成。为了排除所观察到的斑点形成可能是由于外源性SHP2表达导致细胞内蛋白浓度升高，研究者进一步在SHP2敲除的HEK293T细胞中稳定表达了mEGFP-标记的SHP2突变体和WT。SHP2-mEGFP蛋白的表达水平与亲代HEK293T细胞中SHP2的表达水平相同。研究者再次观察到SHP2突变体中形成斑点，而SHP2WT中没有。
值得主要的是，两个癌细胞系H661和CCF-STTG1都分别含有一个内源性NS相关的SHP2N58S或者NS-ML相关的SHP2R498W突变体，也出现了SHP2斑点，而含有两个WT SHP2等位基因的KYSE520经免疫荧光检测只是偶尔有SHP2斑点。研究者进一步在更多生理设置的条件下检测了SHP2斑点的存在，结果发现在Ptpn11D61G/+小鼠源性的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）以及Ptpn11E76K/+小鼠源性的间充质干细胞（MSCs）中SHP2斑点的数量具有高度的统计学意义，而在WT MEFs或者MSCs中没有发现斑点（图1C、D、E、F）。在分别含有一个SHP2A72S或者一个SHP2Q79R突变体的NS病人口腔黏膜细胞中发现了大量SHP2斑点，但是在两个健康的捐赠者中却没有（图1G、H）。这些结果清楚的说明在细胞内疾病相关SHP2突变体具有更高的斑点形成倾向。
图1. 细胞内疾病相关SHP2突变体形成斑点。(A) KYSE520细胞中SHP2WT以及SHP2mut-mEGFP的活细胞成像，标尺为10 mm；(B) SHP2WT以及SHP2mut-mEGFP斑点高内涵数据定量，***p < 0.001；(C) Ptpn11D61G/+以及对照小鼠源系MEF细胞中SHP2免疫荧光成像，标尺10 mm；(D)对图C结果进行定量分析，***p < 0.001；(E) Ptpn11E76K/+以及对照小鼠源系MSCs细胞中SHP2免疫荧光成像，标尺10 mm；(F)对图E结果进行定量分析，***p < 0.001；(G)两个努南综合征患者和两个健康个体源系口腔黏膜上皮细胞中SHP2免疫荧光成像，标尺10 mm；(H)对图G结果进行定量分析，***p < 0.001。
2 细胞内疾病相关SHP2突变体的斑点表现出液滴样的特征
LLPS已经成为许多生物学过程中一种基础的调节机制。研究者评估了SHP2突变体斑点是否具有任意液滴样特征。结果发现NS/JMML和NS-ML SHP2突变体的确形成斑点，斑点能够移动并且一旦相遇就自发融合（图2A）。光漂白(FRAP)后的荧光恢复实验说明一旦光漂白， SHP2- mEGFP突变体斑点的免疫荧光在几分钟内就恢复（图2B、2C）。为了证实内源性SHP2突变体形成的斑点在活细胞中是否具有液滴样的特征，研究者利用CRISPR-Cpf1对H661细胞中带有mEGFP的内源性SHP2N58S突变体等位基因进行标记，随后进行单克隆扩增并且通过测序进行验证。在加工H661细胞的SHP2N58S-mEGFP中观察到与亲代H661细胞内源性SHP2N58S一样的浓缩形成。在加工H661细胞中内源标记SHP2N58S-mEGFP的斑点通过FRAP实验也证实具有浓缩的流动性（图2D）。这些结果提示促进斑点形成的NS/JMML和NS-ML SHP2突变体也表现出动态的液滴样行为。
图2. 细胞中疾病相关SHP2突变体的斑点表现出液滴样特征。（A）两个SHP2E76K-mEGFP斑点的融合，标尺5 mm；（B）KYSE520细胞中对SHP2E76K -mEGFP进行FRAP实验的代表性图像，标尺5 mm；（C）SHP2E76K-mEGFP斑点的FRAP数据定量分析；（D）H661(SHP2N58S)细胞中对内源性标记SHP2-mEGFP进行FRAP实验的代表性图像，标尺10 mm。
3 疾病相关SHP2突变体能够促进体外SHP2的LLPS
研究者进一步探究了体外SHP2是否具有相分离的能力。研究者准备了重组WT和多个疾病相关的SHP2突变体蛋白，结果发现相较于SHP2 WT，NS/JMML和NS-ML突变体形成液滴的能力更强（图3A、B）。显著的是，SHP2突变体在体外形成液滴的潜能与细胞内形成斑点的能力相关（图3C）。SHP2突变体的液滴在一段时间内倾向于结合（图3D）。此外，FRAP实验说明当进行光漂白实验时，SHP2-mEGFP突变体液滴中的荧光能够有效的恢复（图3E），进一步证实SHP2突变体在体外进行典型的LLPS。
研究者通过进行不同浓度SHP2突变体和氯化钠的液滴形成实验建立了SHP2 WT和两个疾病相关突变体SHP2E76K和SHP2R498L的相图。研究者观察到在接近细胞内生理盐水浓度125 mM NaCl存在时，SHP2E76K和SHP2R498L能够从0.25–0.5 mM开始进行LLPS，而SHP2 WT的LLPS从2–4 mM时开始出现（图3F）。研究者随后在多个细胞系中检测了内源性SHP2的蛋白浓度，结果发现细胞内SHP2蛋白的浓度大约在0.3-0.4 mM。假设SHP2突变发生在PTPN11的一个等位基因上，内源性SHP2突变体的浓度(0.15–0.2 mM)接近体外SHP2突变体 LLPS所需要的临界浓度（图3F）。然而细胞内SHP2 WT的蛋白浓度低于体外SHP2 WT LLPS所需要的临界浓度。这一发现帮助解释了为什么细胞内SHP2突变体倾向于形成斑点，而SHP2 WT并没有（图1A）。总之这些结果说明了体外细胞内疾病相关SHP2突变体和SHP2 WT差异的LLPS行为。
图3. 疾病相关SHP2突变体促进体外SHP2的LLPS 。（A）在10% (w/v) PEG3350存在时，8 mM重组SHP2WT以及SHP2mut-mEGFP蛋白液滴形成的代表图像，标尺5 mm；（B）OD600对SHP2WT以及SHP2mut-mEGFP的液滴形成进行量化，***p < 0.001；（C）SHP2WT以及SHP2mut细胞内以及体外LLPS能力的相关性；（D）SHP2E76K的融合，标尺5 mm；（E）对SHP2E76K-mEGFP液滴的FRAP数据进行定量；（F）浓度范围在0.125–8 mM的SHP2WT、SHP2E76K以及SHP2R498L蛋白在20 mM Tris (pH 8.0)、10% (w/v) PEG3350、以及50–500 mM NaCl条件下的相图，蓝点表示没有相分离，红点表示相分离。不同条件下SHP2的LLPS能力用色条表示。
4 从关闭到开放的构象转变促进了SHP2的LLPS
之前对SHP2 WT、NS/JMML突变体以及NS-ML突变体的结构和生物物理分析发现，开放构象的倾向程度与N-SH2/PTP结构域界面动态和溶剂曝光增加、以及N-SH2/PTP结构域间由于突变导致的相互作用减低相关（图4A、B）。有趣的是，基于氢/氘交换的质谱分析结果(H/DX-MS)对SHP2突变体的开放状态进行量化，结果发现SHP2突变体液滴形成LLPS的能力与它们开放构象的倾向相关，无论是NS/JMML还是NS-ML突变体（图4C、D）。这一结果暗示从关闭到开放构象的转变能力决定了SHP2 LLPS的潜能。为了验证这一假说，研究者利用了SHP2变构体抑制剂SHP099，该抑制剂能够在SHP2自体抑制/关闭的构象中稳定SHP2（图4E）。的确，单分子荧光能量共振转移实验(smFRET)说明SHP2E76A主要在开放状态存在，然而，添加SHP009后能够戏剧性的重塑SHP2E76A的构象图谱转变为关闭的构象（图4F）。有趣的是，添加SHP009能够以剂量依赖的方式显著减弱SHP2突变体的液滴形成（图4G、H）。与此一致的是，SHP009处理也能减弱细胞中SHP2突变体斑点的形成（图4I、J）。此外，斑点降低的程度与SHP2抑制的程度相关，例如ET070，相较于SHP009具有更大的SHP2变构抑制作用，对于体外SHP2突变体的LLPS具有更强的抑制作用（图4G、H），并且细胞内的强度也大于SHP009（图4I、J）。研究者观察到在Ptpn11D61G/+MEFs中的SHP2D61G和Ptpn11E76K/+ MSCs中的SHP2E76K液滴的形成在ET070处理后明显被抑制。相反，当用刺激肽段2P-IRS-1处理时能够促进具有相对较弱LLPS能力的SHP2Y279C的液滴形成（图4L、M），该刺激肽段包含bipTyr能够与N-和C-SH2结构域结合，使N-SH2结构域和PTP结构域之间的分子内相互作用打开（图4K）。
研究者接下来检测了LLPS是否是SHP2的内在特性以及开放的构象能否驱动SHP2 WT进行LLPS。结果发现2P-IRS-1也能促进体外SHP2WT凝结形成。显著的是，用生长因子例如bFGF以及EGF处理KYSE520细胞能够诱导SHP2WT- mEGFP斑点的形成，表明当关闭的构象打开时SHP2WT能够进行LLPS。
图4 .开放构象促进SHP2的LLPS。（A）代表性的疾病相关SHP2突变体，NS/JMML突变体（蓝色）以及NS-ML （绿色）；（B）代表SHP2WT和指定SHP2mut固有开放构象的体系；（C）体外LLPS能力与SHP2突变体开放性的相关性；（D）在10% (w/v) PEG3350存在下重组SHP2mut-mEGFP蛋白液滴的代表性成像，标尺5 mm；(E) 图示说明变构抑制剂SHP099将SHP2封锁在一个关闭的构象中；(F) 单分子FRET结果展示SHP099导致SHP2E76A-87/266的构象变化；(G和H)展示利用SHP099和ET070处理SHP2mut液滴，OD600测定液滴浑浊度的时间轨迹；(I和J) 利用SHP099和ET070处理稳定表达SHP2mut-mEGFP的KYSE520细胞，I图对斑点/核进行定量，J图展示了SHP2mut–mEGFP的成像结果；(K) bis-P肽段与SHP2结合的卡通图；(L) 利用w/o (有或无) 1 mM bis-P肽段处理SHP2Y279C蛋白，并且测定液滴的浑浊度，***p < 0.001；
(M) DMSO或者1 mM bis-P肽段处理SHP2Y279C 液滴的成像结果，标尺5 mm。
5 PTP结构域能够驱动静电相互作用介导的SHP2 LLPS
研究者接下来探究了SHP2相分离的分子基础，与大多数进行LLPS的蛋白不同，SHP2并不包含低复杂度的IDRs或者重复的多价模域。为了鉴定负责SHP2 LLPS的结构域，研究者准备了重组全长WT SHP2 (FL-SHP2)以及三个截断体SHP2(SHP2DC, N/C-SH2, SHP2-PTP)（图5A）。值得注意的是，相对于FL-SHP2和其他突变体，催化的PTP结构域LLPS的能力更强（图5B、C）。通过融合实验发现SHP2-PTP的液滴发生融合。有趣的是，变构抑制剂SHP009能够有效的减弱全长SHP2突变体的LLPS，但是不影响SHP2-PTP的液滴形成。
因为PTP结构域的表面包含一些负向和正向的补丁，研究者接下来检测了静电相互作用是否参与调节SHP2 LLPS。的确，SHP2-PTP的液滴形成对NaCl浓度升高高度敏感（图5D）。为了进一步查明调节SHP2-PTP LLPS的关键电荷补丁，研究者构建了分布在SHP2-PTP表面不同电荷补丁的17个SHP2突变体，包括16个双突变和1个单突变。研究者发现6个突变体(R362E/K364E, E523K/D437K, E447K/E481K, E441K/D437K, E447K/D451K, R265E)能够显著降低SHP2-PTP液滴形成。其中E523/D437, E447/E481, E441/D437, E447/D451突变体分布在两个负电荷的补丁（NCPs）上，而R362/K364以及R265坐落在两个正电荷的补丁（PCPs）上。这些结果表明SHP2-PTP蛋白表面的多个NCPs和PCPs调节SHP2-PTP LLPS分子间静电相互作用。不同电荷的补丁中，包含R362/K364的补丁可能发挥主导作用，因为R362E/K364E突变体在不干扰整体结构或者PTP活性的情况下能够消除SHP2-PTP LLPS的能力（图5E、F）。重要的是，引入疾病相关SHP2突变体，R362E/K364E突变体能够整体地消除细胞内不同SHP2突变体的斑点形成（图5G）。
6 LLPS刺激SHP2 PTP活性，对于SHP2突变体诱导的ERK1/2过度活化是必不可少的
SHP2是RAS-MAPK信号通路中关键的正向调节因子。由PTPN11突变体导致的NS和NS-ML综合征属于一个新分类的常染色体显性综合征家族，被称为“RASopathies”。研究者发现在细胞中稳定表达的NS和NSML突变体SHP2，而不是SHP2WT能够提高MEK1/2和ERK1/2的磷酸化水平（图6A）。值得注意的是，尽管LLPS缺陷的R362E/K364E突变体对SHP2 PTP活性没有影响，它们能够减弱疾病相关SHP2突变体诱导的ERK1/2活化（图6B、C），表明疾病相关SHP2突变体的LLPS对于ERK1/2的过度活化是至关重要的。
考虑到LLPS能够在凝结物中局部浓缩分子加速反应，研究者接下来检测了LLPS是否能够促进SHP2的PTP活性。的确，酶学实验发现在LLPS条件下SHP2突变体的液滴表现出更稳健的PTP活性，相较于对应突变体在溶剂条件下（图6D）。DiFMUP去磷酸化的产物(DiFMU)，是SHP2体外合成的底物，在SHP2E76A液滴中浓缩（图6E），提示在相分离的凝集物中SHP2 PTP活性升高。
图6. LLPS刺激SHP2 PTP的活性并且在SHP2突变体诱导的ERK过度活化中必不可少。(A) 对稳转SHP2WT 以及SHP2mutHEK293T细胞中指定蛋白进行免疫印迹；(B) 对稳转指定SHP2突变体HEK293T细胞中指定蛋白进行免疫印迹；(C) 对B中pERK/ERK 水平进行光密度检测，*p < 0.05; **p < 0.01；(D) 在LLPS条件下，以对硝基苯磷酸盐(pNPP)为底物的溶液中SHP2WT 以及SHP2mut的磷酸化活性检测；(E) DiFMUP底物中SHP2E76A的液滴图像。标尺为5 mm。
7 NS-ML SHP2突变体的LLPS招募并且活化SHP2WT促进ERK1/2的活化
如图6D所示，LLPS导致NS-ML突变体中的PTP活性升高，但是仍然弱于SHP2WT，并不能提供证据证明MAPK信号通路是通过NS-ML SHP2突变体活化的（图6A、B）。考虑到NSML患者是基因杂合突变体的携带者，研究者接下来探究了NS-ML突变体SHP2表达的细胞中SHP2 WT等位基因是否促进ERK1/2的过度活化。研究者在HEK293T细胞中以1:1的比例转染SHP2WT和SHP2Y279C，结果发现pERK1/2的水平明显高于只有等量SHP2WT或者SHP2Y279C 表达的细胞（图7A）。有趣的是，WT和NS-ML SHP2的比例很重要，因为在亲代HEK293T或者SHP2 KO HEK293T细胞中转染时SHP2WT和SHP2Y279C的水平大约相等时ERK1/2最大程度的活化（图7B、C）。此外，研究者构建了Tet诱导的SHP2Y279C- mEGFP稳转的KYSE520细胞系，并且用不同浓度的多西环素对SHP2Y279C-mEGFP的表达进行滴定。当SHP2Y279C-mEGFP的表达水平与内源性SHP2相同时，pERK1/2的水平到达高点。这些结果表明WT和NS-ML突变体SHP2之间的相互作用是ERK1/2过度活化机制的基础，正如敲入动物模型和NS-ML患者特异的诱导型多能干细胞(iPSCs)中报道的一样NS-ML SHP2突变体能够过度活化RAS-MAPK。
研究者随后探究了NS-ML突变体SHP2是否能够形成凝集物招募SHP2WT并且促进ERK1/2的活化。研究者的确观察到在SHP2WT自身不足以形成液滴的条件下，SHP2WT已经被分布到NS-ML突变体SHP2液滴中（图7D）。尽管与单独的突变体SHP2相比，WT/突变体SHP2混合物整体的液滴形成能力折中，显著的一部分SHP2WTs在突变体SHP2液滴中富集。在光漂白后SHP2WT迅速恢复。值得注意的是，相较于每个蛋白的液滴，包含WT和NS-ML突变体SHP2混合物的液滴具有更强的PTP活性（图7E）。研究者进一步检测了SHP2突变体细胞中的SHP2WT是否能够通过NS-ML突变体SHP2中液相分离的斑点招募。在KYSE520细胞中转染SHP2WT-mEGFP时并不形成斑点（图1A），然而共表达SHP2R498L时, SHP2WT-mEGFP斑点与SHP2R498L斑点共定位（图7F）。当SHP2WT与SHP2Y279C共表达时也得到了相似的结果。这些结果表明NS-ML突变体SHP2能够形成凝集物招募SHP2WT，并且激活MAPK信号通路（图7G）。
图7. SHP2突变体的LLPS招募和活化SHP2WT进而促进ERK1/2的活化。（A）对瞬时转染表达质粒HEK293T细胞中的指定蛋白进行免疫印迹；(B和C) 在瞬时转染SHP2WT和SHP2Y297C质粒的HEK293T细胞中进行免疫印迹（图B），并且对pERK/ERK的水平进行光密度检测分析（图C）；(D) 代表性成像显示SHP2WT-mEGFP分布在SHP2R498L-mScarlet液滴中，标尺为2.5 mm；(E) 在LLPS条件下，以对硝基苯磷酸盐(pNPP)为底物的溶液中对指定蛋白的酶活性进行检测，***p < 0.001；(F) 对共转染SHP2WT-mEGFP 以及SHP2R498L-mScarlet KYSE520 细胞的活细胞成像，标尺为10 mm；(G) 卡通图说明SHP2mut诱导强LLPS招募SHP2WT并促进ERK激活。
结论
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