科研 | The Plant Cell：AGO2通过激活BG3来调节细胞分裂素在水稻中的分布从而提高粒长和耐盐性（国人高分）
编译：秦时明月，编辑：夏甘草、江舜尧。
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论文ID
原名：ARGONAUTE2 Enhances Grain Length and Salt Tolerance by Activating BIG GRAIN3 to Modulate Cytokinin Distribution in Rice
译名：AGO2通过激活BG3来调节细胞分裂素在水稻中的分布从而提高粒长和耐盐性
期刊：The Plant Cell
IF：9.618
发表时间：2020.05
通讯作者：童红宁
通讯作者单位：中国农业科学院作物科学研究所
DOI号：10.1105/tpc.19.00542
实验设计
本试验所用植物材料为粳稻品种中花11。对AGO2基因构建了不带标签的A2OX 过表达株系以及携带Flag标签的A2FOX过表达株系、BG3过表达株系以及TCSn:GUS转基因株系，同时利用CRISPR/Cas9构建了AGO2-KO突变株系、AGO2+AGO3双突株系以及BG3突变株系。首先对这些转基因株系进行表型鉴定，包括籽粒大小测定及耐盐性测试，以及ABA敏感性测试。之后对A2OX过表达株系与野生型植株进行转录组分析，鉴定差异表达基因，并利用Chip-seq及Chip-qPCR对筛选的基因进行进一步验证。最后，研究人员测定了A2OX过表达株系与BG3过表达株系的细胞分裂素分布与含量，并通过对TCSn:GUS转基因株系进行GUS染色试验确定了细胞分裂素分布与耐盐性的关系。
结果
为了分析AGO2在植物中的作用，研究人员通过CRISPR/Cas9，获得了几个等位的AGO2突变体和AGO2+AGO3双突变体。然而，与野生型水稻相比，这些突变体表型变化很少。研究人员通过在野生型水稻中过表达AGO2编码序列或在花椰菜花叶病毒35S启动子控制下的AGO2-Flag融合基因进行转基因分析。值得注意的是，研究人员获得了几个独立的转基因株系，它们的粒长和千粒重显著增加，但粒宽没有改变，伴随着AGO2表达的增加(图1A-F)。总体而言，A2OX植株在叶片、籽粒长度和粒数方面表现出比AGO2-Flag过度表达(A2FOX)植株更强的表型(图1A-F)。结果表明，AGO2 C末端的标签融合对蛋白质功能有损伤作用，但不能消除蛋白质功能，表明该方法可作为转基因分析中蛋白质研究的一种策略。统计分析表明，A2FOX的单株产量显著高于野生型，但A2OX的单株产量没有因粒数减少而改变(图1G)，表明AGO2可能是改良籽粒产量和/或籽粒品质(粒长)的有价值的育种目标。
图1过表达AGO2可以增加籽粒长度和产量。(A) A2OX和野生型(WT)植株籽粒长度的比较。(B)比较A2FOX和WT的籽粒长度。(C)A2OX和WT的大体形态。(D)A2FOX和WT的大体形态。(E)AGO2在WT和转基因植株中的表达。(F)和(G)指定植物的粒长和单株产量。
2 AGO2提高了盐胁迫的耐受性，并正向调节ABA 响应
微阵列分析显示，AGO2的表达受到各种压力的影响，这表明AGO2参与应激反应。事实上，A2OX植物也显示出极大的耐盐性增强(图2A至2D)。在测试的两个品系中，转基因植株存活率保持在50%以上，而几乎所有野生型植物在持续暴露于高盐度(200 mM NaCl)后死亡。A2FOX植物也表现出更高的耐盐性(图2E至2H)，尽管程度低于A2OX。丙二醛(MDA)是与盐胁迫相关的脂质过氧化的最终产物。在正常生长条件下，A2OX和野生型的MDA含量相当(图2I)。然而，在盐处理下，A2OX的MDA含量远低于野生型(图2I)，进一步支持了AGO2在调节抗逆性方面的积极作用。为了探索其潜在的机制，研究人员分析了植物对ABA的反应。A2OX植株对ABA的敏感性显著增强(图2J至2L)，表明AGO2正向调节ABA反应以提高水稻的抗逆性。
图2 AGO2正向调节耐盐性和ABA反应。(A)-(H)所示植物在盐处理前后的大体形态(A、C、E、G)和存活率的统计数据(B、D、F、H)。(I)正常条件(未处理)和盐胁迫条件(200 mM NaCl，6d)下生长的A2OX植株的丙二醛(MDA)含量。(J)-(L)经ABA处理或不经ABA处理的指示植物的大体形态(J)以及相应的枝长(K)和根长(L)的统计数据。
3 AGO2过表达激活BG3并促进基因表达
用A2OX-4和野生型植物进行的转录组分析确定了1514个上调和584个下调的差异表达基因DEGs (图3A)，表明AGO2可能促进基因表达。GO富集分析显示，DEG在应激相关过程中明显富集，如应激反应和氧化应激反应。然而，也检测到一些额外的GO分类，如染色质组装和转录调节。在这些高度激活的基因中，研究人员发现了BG3，它最近被证明可以调节籽粒大小。对两株A2OX进行RT-qPCR分析，证实BG3表达增强(图3B)。bg3-D是一个激活了BG3表达的突变体，BG3过表达的植物都表现出籽粒增大和叶片生长增加，这与A2OX的表型非常相似(图3C)。这些结果提示AGO2的功能是通过激活BG3的表达来实现的。
研究人员选择了另外四个在A2OX-4中上调的DEG进行验证，发现它们在A2OX和BG3OX中的表达都大大增加(图3D)。进一步的全转录组分析显示，在从bg3-D鉴定的DEG中，55.9%(301/538)在A2OX中也有差异表达(图3E)。其中，99.3%(299/301)的基因表达方向一致，93.3%(279/301)的基因受到BG3和AGO2的共同上调(图3e)，强烈表明BG3介导了AGO2诱导的一组基因的调控。
图3 AGO2激活BG3调节基因表达。(A)与WT相比，A2OX-4上调和下调DEG的数量。(B)BG3在A2OX植物中的表达增加。(C)WT和BG3过表达植株的粒长比较。(D)WT、A2OX和BG3OX植物中四个上调DEG的表达分析。(E)显示AGO2和BG3调控基因重叠的Venn图。
4 BG3正向调节盐胁迫耐性和ABA反应
除了籽粒大小增加外，bg3-D和BG3OX都表现出很强的耐盐性(图4A至4D)。盐处理后，它们的存活率仍保持在80%以上，而野生型植株几乎全部死亡。相比之下，BG3基因敲除突变体对盐处理表现出超敏反应(图4E-H)，表明BG3在调节盐胁迫反应中起作用。研究人员测试了这些植物对脱落酸(ABA)的反应。BG3表现出轻微的ABA敏感性，而bg3-D和BG3OX在地上部和根的生长方面表现出显著的ABA敏感性(图4I-K)，这意味着BG3也参与了ABA反应的调节。
图4 BG3正向调节耐盐性和ABA反应。(A)-(D)盐处理前后BG3过表达植株的大体形态(A和C)和存活率的统计数据(B和D)。(E)-(H)盐处理前后BG3基因敲除植株的大体形态(E和G)和存活率的统计数据(F和H)。(I)-(K)经ABA处理或不经ABA处理的指示植物的大体形态(I)以及相应的地上部长度(J)和根长(K)的统计数据。
5 AGO2需要BG3促进颗粒大小和耐盐性
与A2OX相比，bg3-D的粒径更大，抗逆性更强，这与BG3在BG3-D中的高表达水平一致，有力地表明AGO2通过促进BG3的表达来调节籽粒大小和抗逆性。为了证实这一猜测，研究人员用CRISPR/Cas9编辑了A2OX-8中的BG3，并获得了一些独立的敲除株系。与A2OX-8品系相比，所有这些品系的籽粒长度均显著降低(图5A-B)。研究人员使用了两个有代表性的品系进行盐胁迫测试，发现与A2OX-8相比，这两个品系的耐盐性都有所下降(图5C-F)。然而，编辑后的植物仍然比野生型的籽粒略长，耐盐性提高(图5A和5B)，这可能是由于BG3同源物之间的冗余功能。或者，也许AGO2的活性并不完全依赖于BG3。这些结果表明，BG3参与并至少部分参与了AGO2促进籽粒长度和耐盐性的作用。
图5 AGO2功能需要BG3。(A)A2OX-8和BG3基因敲除植株籽粒长度的比较。(B)指定植物的谷粒长度统计数据。(C)-(F)盐处理前后A2OX-8和BG3基因敲除植株的大体形态(C和E)和存活率的统计数据(D和F)。
6 AGO2通过表观遗传修饰激活BG3表达
值得注意的是，AGO2和BG3都受到盐处理的显著抑制，尤其是BG3，其表达水平在盐处理后迅速下降(图6A-B)。然而，在AGO2结构性过表达的A2OX植物中，BG3仍然受到盐的强烈抑制，这表明盐对BG3表达的抑制可能部分不依赖于AGO2。染色质免疫共沉淀测序(Chip-seq)分析表明，AGO2-Flag倾向于在BG3区域内积累。Chip-qPCR分析进一步证实了这一结果，结果表明，与野生型相比，A2FOX植物中AGO2-Flag在BG3启动子区域以及编码区明显富集(图6C)。AGO蛋白可能通过表观遗传修饰调节基因转录。因此，研究人员在野生型和A2OX植物中检测了BG3上的DNA甲基化和组蛋白甲基化。虽然A2OX和野生型BG3启动子区域的DNA甲基化水平相似，但研究人员观察到A2OX中BG3基因座的组蛋白甲基化水平发生了显著变化(图6D-E)。与野生型相比，A2OX植物中已知的基因激活的表观遗传标记H3K4me3的水平升高(图6D)，而基因抑制的表观遗传标记H3K27me3的水平降低(图6E)。因此，AGO2很有可能在BG3位点上变得丰富，从而促进表观遗传修饰来激活基因表达。重要的是，在拟南芥中发现了类似的Ago1活性机制。基于这些结果，研究人员推测AGO2通过调节染色质修饰作为转录激活因子，BG3代表该蛋白的一个主要靶点。
图6 AGO2通过表观遗传修饰调节BG3的表达。(A)和(B)盐对WT植株AGO2(A)和BG3(B)表达的影响。(C)使用A2FOX-1通过Chip-qPCR检测BG3位点不同区域上的AGO2-Flag。(D)和(E)用A2OX-8 的Chip-qPCR检测BG3区域组蛋白甲基化状态。
7 细胞分裂素在AGO2过表达植物中的分布改变
由于BG3编码了一种可能的细胞分裂素转运蛋白，其可以促进细胞分裂素从地上到根的运输，研究人员测量了A2OX和野生型植物的地上和根中各种细胞分裂素的含量(图7A-B)。在地上部，A2OX植株的iP、tZ、cZ及其几种结合态的含量显著低于野生型。相反，在根中，研究人员观察到A2OX中几种细胞分裂素的水平增加，在这两种植物中都没有检测到iP、tZ水平在不同植物之间的显著差异；并且检测到丰富的cZ，其中A2OX的水平比野生型高得多。在结合形式中，A2OX降低了iPR和cZO-葡萄糖苷的水平，而iPR-7-葡萄糖苷(IP7G)、tZ-9-葡萄糖苷和cZR的水平显著高于野生型。当研究人员检查三种主要的细胞分裂素活性形式的组合水平时，观察到与野生型相比，地上部的细胞分裂素水平明显下降，而A2OX根部细胞分裂素水平相应地增加(图7C-D)。这些结果进一步强化了AGO2促进BG3表达的观点，这种表达改变了细胞分裂素在植物中的分布，从而调节了颗粒大小和胁迫反应。有趣的是，BG3只在A2OX的茎中被激活，而在根中不被激活，暗示这个调控以组织依赖的方式发生，这可能解释了A2OX和bg3-D之间略有不同的细胞分裂素分布模式。
图7 AGO2调节细胞分裂素的分布。(A)和(B)WT和A2OX-8幼苗地上部(A)和根(B)中各种形式细胞分裂素的定量。(C)和(D)地上部(C)和根部(D)中三种主要活性细胞分裂素形式的总量。
8 盐胁迫改变细胞分裂素的空间分布格局
根据这些结果，研究人员推测A2OX和BG3OX耐盐性的提高可能归因于细胞分裂素在这些植物中分布的改变。因此，研究人员检测了细胞分裂素的分布是否与盐胁迫反应有关。双组分信号传感器新基因(TCSn)是拟南芥和玉米中对细胞分裂素敏感的人工合成基因启动子。为了评价盐胁迫对细胞分裂素分布的影响，研究人员通过将TCSn：GUS载体导入野生型水稻构建了细胞分裂素报告系。盐处理后初生根的根冠和维管柱中的GUS染色较未处理的对照明显增强(图8A-B)。值得一提的是，一仅在盐处理植株的主根伸长/分化区中检测到深色区域(图8B)。相比之下，盐处理下茎尖的GUS表达区显著减少(图8A，C)。这些结果表明，盐胁迫诱导根中细胞分裂素水平增加，而地上部细胞分裂素水平下降，这种模式与A2OX植物相似。
为了验证这些结果，研究人员直接量化了盐处理和未处理植株的地上部和根部中各种细胞分裂素的含量(图8D-E)。与未处理植株相比，盐处理植株地上部IP7G水平升高，iP、iPR、tZ和tZR水平显著降低，而包括cZ在内的其他细胞分裂素水平变化不大。相反，在根中，iP和tZ水平对盐处理的响应变化不大，而cZ水平在盐处理的植株中显著增加。在含量变化的细胞分裂素结合形式中，盐处理降低了iPR和cZO-葡萄糖苷的含量，而增加了IP7G、tZR和cZR的含量。总体而言，这种分布模式与A2OX植物的分布模式高度相似。通过结合细胞分裂素的三种主要活性形式进行比较，发现盐处理植物的最显著变化，包括地上部iP和tZ水平的下降，以及根中cZ水平的上升，与A2OX植物中观察到的变化基本相同(图8F-G)。这些结果，结合GUS分析的结果，表明细胞分裂素分布的改变是植物对盐胁迫的主要反应。
结论
在本研究中，研究人员发现过表达AGO2同时增加了水稻籽粒大小和抗盐性。这是通过BG3表达的表观遗传激活而获得的。研究人员发现盐胁迫可以改变地上部和根部细胞分裂素的分布模式，表明BG3在细胞分裂素分布模式的建立中起着重要作用，而细胞分裂素分布模式在胁迫响应和籽粒发育过程中都起着至关重要的作用。优化细胞分裂素在植物中的分布模式是同时提高谷物产量、谷物品质和抗逆性的一种育种手段。
评论
高产稳产是作物育种的长久目标，但由于作物产量和抗性往往具有一定的补偿效应，如何在不利条件下保持高产是育种工作的重大挑战。细胞分裂素在植物生长发育过程中发挥着重要作用，且有其复杂的转运系统，但在作物中对其功能了解甚少。该研究首次发现，植物可通过调整细胞分裂素的空间分布对高盐胁迫做出响应，从而提高对胁迫的适应性。通过操纵参与此过程的关键组分，不仅可发挥细胞分裂素促进生长发育的功能，还可大幅增强植物的耐逆性。与整体操纵激素的含量不同，操纵激素转运体现了一种更经济弹性的原则，并有望克服高产高抗之间的矛盾，因此在分子设计育种上具有巨大潜力。在这此理论基础上，研究人员发现过表达 AGO2 或 BG3 均可通过改变细胞分裂素空间分布显著增加水稻粒长和耐盐性，从而验证了这一途径的可行性。