科研 | 裴雪涛/岳文：HGF是人脐带间充质干细胞治疗AD的关键因子（国人佳作）
编译：猪宝，编辑：夏甘草、江舜尧。
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论文ID
原名：HGF Mediates Clinical‐Grade Human Umbilical Cord‐Derived Mesenchymal Stem Cells Improved Functional Recovery in a Senescence‐Accelerated Mouse Model of Alzheimer's Disease
译名：HGF介导临床级人脐带间充质干细胞促进老年痴呆小鼠模型的功能恢复功能恢复
期刊：Advanced Science
IF：15.84
发表时间：2020.07
通讯作者：裴雪涛&岳文
通讯作者单位：军事医学科学院&广州华南生物医药研究院
DOI号：10.1002/advs.201903809
实验设计
结果
1 临床级别的hUC-MSCs提高SAMP8小鼠的空间学习能力和记忆力
Morris水迷宫实验结果表明，在第3、4、5天，SAMP8-PBS处理组（P8-PBS）的逃避潜伏期长于正常SAMR1小鼠（R1）和SAMP8-MSC处理组（P8-MSC）。从第5天的行动轨迹（图1B、C）和在各象限停留时间（图1E）而言，R1和P8-MSC组小鼠的运动具有趋向性，但是三组的运动速度无显著差别（图1F）。当隐藏的平台移除后，将1min内小鼠穿越原先平台所在位置的次数作为衡量空间记忆能力的指标，可以看出P8-PBS组小鼠穿越平台位置的次数显著低于R1和P8-MSC组（图1G）。在为期2天的穿梭箱实验中，R1和P8-MSC组小鼠10次成功穿梭中所发生的失败次数显著少于P8-PBS组小鼠，表明R1和P8-MSC小鼠在光、声响、电流的交互关系中具备的学习和记忆能力更强（图1H）。在旷场实验中，R1和P8-MSC组小鼠较P8-PBS组小鼠在中心区域停留的时间更长，但三组小鼠的运动速度无显著差别（图1G）。Y迷宫实验（图1I）和新物体识别测试（图1K）中，R1和P8-MSC组小鼠在新区域和探索新物体的时间长于P8-PBS组小鼠，表明R1和P8-MSC组小鼠对原先环境的记忆能力更强。综上，这些结果表明移植hUC-MSCs相较于注射PBS有助于提高AD小鼠的认知功能。
图1 hUC-MSCs提高SAMP8小鼠的空间学习能力和记忆力。A）hUC-MSCs或PBS处理、Morris水迷宫实验、穿梭箱实验、Y-迷宫实验、旷场实验、新物体识别测试的时间安排示意图。B-G）Morris水迷宫实验用以评估R1、P8-PBS、P8-MSC三组小鼠的认知情况。第五天寻找隐藏平台实验中代表性轨迹图（B）、逃离潜伏期（C）、四个象限活动时间（E）。D）学习曲线展示了第3、4、5天的每日逃离潜伏期。F）三组小鼠的平均运动速度无显著差别。G）穿越平台的平均次数。H）2天的穿梭箱实验记录10次成功穿梭中所发生的失败的次数。Y迷宫和新物体识别测试中三组小鼠停留在新区域（I）和探索新物体（K）的时间记录。（J）三组小鼠旷场实验中运动速度无显著差别。（每一幅图中的散点表示每只小鼠实验结果及数据分布，柱状图展示了平均值及误差。n=8-11，所有数据均以平均值±标准误表示，*P < 0.05, **P < 0.01）。
2 hUC-MSCs调节AD相关重要蛋白的表达并助于AD小鼠大脑的内源神经发生
为了探究认知功能的改善是否伴随着大脑中关键蛋白的改变，这里采用免疫组化和/或Western Blot对三组小鼠海马和大脑皮层区域几个代表性蛋白的表达水平进行评估。相较于PBS组小鼠，MSC处理组小鼠的海马结构（图2A、E）和大脑皮层（图S2）中与AD相关的蛋白p-Tau (Thr181)、BACE1、pGSK3𝛽 (Tyr216)、𝛽-amyloid precursor protein (APP)、presenilin 1 (PS1)的表达水平显著降低。已有临床前研究表明内源神经再生和神经可塑性的增强能够逆转认知受损，因此这里进一步分析了小鼠海马冠状切增殖的Nestin+和SOX2+干细胞。结果表明，P8-PBS组小鼠CA1区域和大脑皮层特定区域Nestin+干细胞数目（图2B、C、F）以及齿状回区域SOX2+干细胞的数量（图2D、F）显著少于R1组和P8-MSC组。此外，体外实验中还发现加入hUC-MSCs-CM后小鼠原代海马神经干细胞（NSCs）增殖速率提高。总之，这些结果表明hUC-MSCs能够调节主要的AD相关蛋白的表达，从而减轻神经损伤；同时hUC-MSCs可以激活内源神经再生，有助于稳定海马区域神经网络。
图2 hUC-MSCs调节AD相关重要蛋白的表达并助于AD小鼠大脑的内源神经发生。A）R1、P8-PBS、P8-MSC三组小鼠海马齿状回区域pTau (Thr181)、 BACE1和pGSK3𝛽 (Tyr216)蛋白免疫组化的代表性图片。B、C）免疫组化方法评估hUC-MSCs对内源神经发生的影响。（B）大脑冠状切片中Nestin+细胞在海马区域分布情况的代表图。（C）绿框和红框分别代表皮层和海马Nestin+干细胞聚集的特定区域，右图为高倍放大图。CA1区域（C，左图）和皮层特定区域（C，右图）图像和增殖数量统计。D）齿状回区域增殖的Sox2+干细胞图像和数据统计。E）Western Blot结果展示R1、P8-PBS、P8-MSC三组小鼠大脑海马区域pTau (Thr181)、pGSK3𝛽 (Tyr216)、APP、BACE1和PS1蛋白的表达水平。F）Western Blot结果展示三组小鼠大脑海马和皮层区域Nestin和Sox的表达情况。（n=8-10；所有数据均以平均值±标准误表示，*P < 0.05, **P < 0.01）。
3 hUC-MSCs修复冈田酸诱导的神经细胞损伤模型
使用冈田酸诱导的AD细胞模型进一步探究hUC-MSCs是否能够修复受损的神经元。对照组原代神经元呈多边形体、轴突较长、树突丰富；经OA诱导后，细胞形态转变为圆形，轴突缩短、弯曲、断裂。而hUC-MSCs-CM处理组的神经元即使经OA诱导，仍能较好地维持神经元形态特征（图3A）。高内涵细胞成像分析揭示OA组神经元细胞骨架分支的数量（图3A，右图）和神经突突起的总长度均显著减少，而CM处理组有显著恢复。SH-SY5Y细胞表现出相似的细胞形态特征（图3B）。此外，高内涵细胞成像分析发现OA组神经元和SH-SY5Y细胞的线粒体膜电位显著降低，而CM处理组有部分的恢复（图3C）。CM处理后，神经元和SH-SY5Y细胞的细胞活性较OA组均有增强（图3D）。通过Dil染色验证hUC-MSCs是否对树突棘的大小产生影响。对三组次级树突的树突棘数据进行分析（图3E），原代神经元OA组次级树突的长度和密度均小于对照组，但是经过hUC-MSCs处理后，树突棘的大小显著恢复（图3F）。tau蛋白磷酸化水平也利用Western Blot进行评估，结果发现hUC-MSCs部分抑制了OA处理的SH-SY5Y细胞的tau蛋白磷酸化（图S4）。以上数据表明hUC-MSCs在体外AD细胞模型中能有效地修复OA诱导的神经细胞损伤。
4 hUC-MSCs分泌的HGF治疗OA诱导神经细胞损伤建立的AD细胞模型
明确了hUC-MSCs在AD体内和体外模型中的作用后，接着主要探究hUC-MSCs的治疗机制——hUC-MSCs分泌的哪种功能因子在调节认知功能和神经损伤恢复的过程中扮演重要角色？这里测定了3株不同脐带来源的hUC-MSCs在4个代次下条件培养上清中174个已知因子的含量，通过聚类分析得到稳定且可靠的数据。由热图可以看出（图4A），UC1-MSCs和UC2-MSCs分泌因子更加相似（相较于UC3-MSCs），它们的增殖能力也更为接近（结果未展示）。经过研究，最终选择其中4个信号较强的因子，IL-6、HGF、ANG和GRO，推测它们可能参与了神经损伤修复。利用OA诱导的神经损伤模型评估4个因子的作用，结果表明只有HGF才能显著修复受损的原代神经元（图S5A、B、E、F）和SH-SY5Y细胞（图S5C、D），使其接近对照组水平。IL-6也具有一定的修复能力，而ANG和GRO在细胞模型上则未体现出效果。因此，下一步主要研究hUC-MSCs分泌的HGF的功能。
从神经元的细胞骨架分支角度数量而言，HGF处理组有显著恢复（图4C、F）。HGF组的树突棘长度和CM组接近（图4D、G），而HGF组的线粒体膜电位则显著恢复（图4E、H）。以上结果表明，HGF能有效恢复和治疗体外AD细胞模型中OA诱导的神经元损伤。
在MSCs处理组中添加HGF中和抗体（HGFAb）进一步验证HGF在神经损伤恢复中的作用。添加了HGFAb后，CM的治疗效果显著削弱（图4C-H）。此外，在OA诱导SH-SY5Y细胞损伤模型中发现，HGFAb同样会削弱CM恢复神经突长度和增殖能力的作用（图S6）。透射电子显微镜的形态学超微结构分析发现，OA-SH-SY5Y细胞的线粒体出现塌缩、肿胀和具有大量次级溶酶体和残质体的空泡。经过HGF和CM处理后，OA-SH-SY5Y细胞的线粒体形状恢复椭圆形，且线粒体嵴排列整齐。而添加了HGFAb的CM修复作用被显著抑制（图4I）。综上，这些数据说明hUC-MSCs分泌的HGF在hUC-MSCs调节的神经损伤修复中具有重要作用。
图4 hUC-MSCs分泌的HGF治疗OA诱导神经细胞损伤建立的AD细胞模型。A）3株不同脐带来源的hUC-MSC-CM 4个不同代次（3,5,11,15代）下分泌细胞因子的热图。B）值超过1000的18个表达信号最强的因子。C）F-actin （红）/Tuj-1（绿）标注的神经元共聚焦图像。D）原代神经元Dil染色的共聚焦图像。E）JC-1标记的神经元代表性共聚焦图像。F-H）Thermo Cellomics Cell Insight CX5高内涵分析系统对骨架分支数量（F）、树突棘长度（G）、红/绿荧光密度（H）数据的定量分析。I）SH-SY5Y细胞线粒体形态超微结构的透射电镜图。（n=7-10；所有数据均以平均值±标准误表示，*P < 0.05, **P < 0.01）。
5 HGF改善SAMP8小鼠的认知功能并调节关键AD相关蛋白的表达
Morris水迷宫实验结果表明，P8-PBS组小鼠的逃避潜伏期在第2、3、4、5天均长于R1和P8-HGF组（图5D）。第五天时，R1和P8-MSC组小鼠的运动轨迹（图5B、C）和各象限停留时间（图5E）均更有趋向性，但三组小鼠的运动速度无显著差别（图5F）。当隐藏的平台移除后，将1min内小鼠穿越原先平台所在位置的次数作为衡量空间记忆能力的指标，可以看出P8-PBS组小鼠穿越平台位置的次数显著低于R1和P8-HGF组（图5G）。在穿梭箱实验中，R1和HGF组小鼠完成特定穿梭次数的时间短于PBS组（图5H）。在旷场实验中，R1和HGF组小鼠在中心区域停留的时间较PBS组更长，但三组小鼠的移动速度无明显变化（图5J）。在Y迷宫实验（图5I）和新物体识别测试（图5K）中，R1和HGF组小鼠在新区域以及新物体探索上花费的时间比PBS组小鼠较长。此外，HGF组小鼠比PBS组小鼠的兴奋性突触后电位斜率更高，说明HGF可以增强SAMP8小鼠的海马突触可塑性（图S7A）。在恐惧条件反射反应中，HGF处理组的小鼠表现出更强的声和电联想记忆（图S7B）。
SAMP8小鼠表现出许多AD的神经病理特征，比如老年斑、神经原纤维缠结（neurofibrillary tangles，NFT）、神经炎症等，且tau蛋白磷酸化程度增加。通过硫黄素-S染色对SAMP8小鼠大脑海马神经元的NFT病理特征进行可视化，发现PBS组小鼠比SAMR1小鼠在DG区域有更多的NFT，并且MSC和HGF处理组小鼠的DG区域NFT少于PBS组小鼠。同时，A𝛽蛋白的分布特征与NFT相似（图S8）。这些效果和疾病相关小胶质细胞神经炎症的逆转部分相关——可以看到小胶质细胞诱导产生的促炎因子（IL-1𝛽 和 TNF-𝛼）表达水平降低，抗炎因子（IL-4）表达水平升高，说明hUC-MSCs和HGF都具有神经保护作用（图S9）。
综上，这些结果表明HGF能够改善SAMP8小鼠的认知功能并调节关键AD相关蛋白的表达。
图5 HGF改善SAMP8小鼠的空间学习和记忆能力。A）HGF或PBS处理、Morris水迷宫实验、穿梭箱实验、Y-迷宫实验、旷场实验、新物体识别测试的时间安排示意图。B-G）Morris水迷宫实验用以评估R1、P8-PBS、P8-HGF三组小鼠的认知情况。第五天寻找隐藏平台实验的代表性轨迹图（B）、逃离潜伏期（C）、四个象限活动时间（E）。D）学习曲线展示了第2、3、4、5天的每日逃离潜伏期。F）三组小鼠的平均运动速度无显著差别。G）穿越平台的平均次数。H）2天的穿梭箱实验记录10次成功穿梭中所发生的失败的次数。Y迷宫和新物体识别测试中三组小鼠停留在新区域（I）和探索新物体（K）的时间记录。（J）三组小鼠旷场实验中运动速度无显著差别。（n=8-11，所有数据均以平均值±标准误表示，*P < 0.05, **P < 0.01）。
6 抑制HGF分泌削弱hUC-MSCs对SAMP8小鼠空间学习和记忆能力的增强作用
构建HGF缺陷的hUC-MSCs（MSCShHGF）和对照MSCs（MSCCon）（图6B）。MSCShHGF的HGF表达水平显著低于对照MSCs（MSCCon）和野生型hUC-MSCs （MSCWT）（图6C-E）。对8w的SAMP8小鼠分别注射MSCWT、MSCCon 、MSCShHGF和PBS（图6A），随后进行行为学评估（图6F-M）。
Morris水迷宫实验结果表明，P8-MSCShHGF组小鼠的逃避潜伏期在第5天长于R1、MSCWT和MSCCon组（图6F-H）。当隐藏的平台移除后，将1min内小鼠穿越原先平台所在位置的次数作为衡量空间记忆能力的指标，可以看出P8-MSCShHGF组小鼠穿越平台位置的次数显著低于P8-MSCCon组（图6I）。在穿梭箱实验中，第2天中MSCShHGF组小鼠完成特定穿梭次数的时间长于R1、MSCWT和MSCCon组（图5J）。在旷场实验中，R1、MSCWT和MSCCon组小鼠在中心区域停留的时间较PBS组更长，但MSCShHGF组和MSCCon组并无显著差别（图6L）。在Y迷宫实验（图6K）和新物体识别测试（图6M）中，MSCShHGF组小鼠在新区域以及新物体探索上花费的时间比R1、MSCWT和MSCCon组的小鼠较短。以上实验结果表明hUC-MSCs移植能够改善AD小鼠的认知功能，而抑制HGF分泌后hUC-MSCs增强SAMP8小鼠空间学习和记忆能力的作用被大大削弱。这说明HGF在hUC-MSCs调节SAMP8小鼠认知功能损伤恢复的过程中扮演重要角色。
图6 抑制HGF分泌削弱hUC-MSCs对SAMP8小鼠空间学习和记忆能力的增强作用。B）建立HGF缺陷的hUC-MSCs（MSCShHGF）和对照MSCs（MSCCon），以野生型hUC-MSCs（MSCWT）为阳性对照。GFP阳性率达到90%，说明转染效率高。MSCShHGF和MSCCon的HGF表达水平用qPCR（C）、Western Blot（D）和ELISA（E）方法评估，结果表明MSCShHGF的HGF表达水平显著低于MSCCon和MSCWT（n=3/组）。A）实验安排示意图。F-I）Morris水迷宫实验用以评估R1、PBS、MSCShHGF、MSCCon和MSCWT各组小鼠的认知情况。第五天寻找隐藏平台实验的代表性轨迹图（F）和逃离潜伏期（G）。H）五组小鼠的平均运动速度。I）穿越平台的平均次数。J）2天的穿梭箱实验记录10次成功穿梭中所发生的失败的次数。Y迷宫和新物体识别测试中三组小鼠停留在新区域（K）和探索新物体（M）的时间记录。（J）五组小鼠旷场实验中运动速度无显著差别。（n=8-10/组；所有数据均以平均值±标准误表示，*P < 0.05, **P < 0.01；#P < 0.05, ##P < 0.01）。
7 HGF通过活化cMet-AKT-GSK3𝜷信号通路介导hUC-MSCs调节tau蛋白过磷酸化
由于c-Met是HGF的高亲和力受体，这里使用HGF R/c-Met抗体（cMetAb）阻断OA诱导的原代神经元和SH-SY5Y细胞中HGF与c-Met的结合（阻断效率达90%，图7和图S10）。HGF组细胞的骨架分支数（图7A）、树突棘的长度（图7B）、线粒体膜电位水平（图7C）均有恢复，但cMetAb加入后HGF的修复作用显著降低（图7D-F）。SH-SY5Y细胞也表现出相似的特性（图7G-I、图S10），CM和HGF的修复作用在加入cMetAb后均受到显著抑制。此外，OA诱导损伤的神经元的线粒体形态超微结构出现塌缩、肿胀和裂解。经过HGF和CM处理后，神经元的细胞骨架得到显著恢复，而加入cMetAb后恢复作用显著减少。这些结果说明c-Met是HGF在体外调节神经损伤修复的重要受体。
接着，采用基于海马组织的探索性mRNA微阵列寻找潜在的通路。将海马组织样品分为四组：R1、PBS、hUC-MSC、HGF，每组包含4个不同的海马组织样品，因此共有16个总样品。获得差异表达基因后，以和PBS组相比表达水平差异1.5倍作为阈值筛选基因，共得到19个基因（图8A）。利用KEGG通路分析用以探究目的基因富集的信号转导通路（图8B），如肌动蛋白骨架调节、PI3K-AKT信号通路、PPAR信号通路、Rap1信号通路、FoxO信号通路。通路分析表明更多基因与PI3K-AKT通路有关（图8C）。对OA诱导的SH-SY5Y细胞模型用免疫印迹方法检测p-AKT（Ser473）和p-GSK3𝛽（Ser9），结果表明OA-SH-SY5Y细胞的p-AKT和p-GSK3𝛽比对照组低（图8G、H）。CM和HGF处理可以显著提高p-AKT和p-GSK3𝛽，但该作用部分被cMet-Ab抵消（图8G-I）。
对OA-SH-SY5Y细胞模型tau蛋白的Ser396、Thr212和Ser214磷酸化位点分析发现，OA诱导显著提高tau蛋白在这几个位点的磷酸化水平（图8D、E）。CM和HGF处理均能显著降低OA诱导增加的磷酸化水平，而该作用部分受到cMet-Ab抑制（图8J-L）。
P8-PBS小鼠相较于R1小鼠，其tau蛋白磷酸化在Ser396、Thr181和Ser404这三个位点显著提高。hUC-MSCs和HGF均能降低P8-PBS小鼠tau蛋白在这几个位点的磷酸化水平（图8J、L-左图）。P8-PBS小鼠AKT （Ser473）和GSK3𝛽 （Ser9）的磷酸化水平均降低，而hUC-MSCs和HGF处理均能恢复p-AKT和p-GSK3𝛽水平（图8K、L-右图）。
讨论
评论
阿尔兹海默症已成为威胁人类健康甚至生命的主要疾病之一，然而目前仍无有效治疗手段。干细胞移植治疗阿尔兹海默症是一种具有潜力的方法，其中hUC-MSCs因具有产量高、无侵入性和伦理问题等优势，具有广阔的应用前景。已有不少研究表明hUC-MSCs对AD的治疗有积极作用，但何种分泌因子在认知功能损伤的恢复中发挥作用仍有待进一步的研究。
本文采用临床级hUC-MSCs进行研究，较大程度上保证了结果的可重复性和科学性。通过动物实验和细胞模型实验，表明hUC-MSCs对AD具有治疗效果，并找到关键作用分子HGF及其关键信号通路cMet-AKT-GSK3𝜷。
该研究表明hUC-MSCs是具有潜力的AD治疗方法之一。此外，由于HGF在血液中稳定存在并且可以穿越血脑屏障进入脑实质，其有望与hUC-MSCs结合甚至代替细胞应用于AD治疗。该研究也为其它神经退行性疾病的研究提供借鉴。
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