科研 |NEURON：细胞类型特异性转录组学揭示突变的亨廷顿蛋白导致线粒体RNA释放和神经元固有免疫激活
编译：稻和，编辑：景行、江舜尧。
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亨廷顿病(HD)是一种由Huntingtin(HTT)基因第1外显子的CAG三核苷酸重复扩增引起的致命神经退行性疾病。在HD中，突变的亨廷顿蛋白（mHTT）导致神经元细胞死亡的机制尚未完全明确。为了探究其中新的分子机制，本文研究人员利用单核RNA测序（snRNA-seq）和翻译核糖体亲和纯化（TRAP）的方法介导了人HD与鼠HD模型尾状核/壳核(纹状体)细胞类型特异性基因表达变化的转录组分析。结果表明，在HD最脆弱的纹状体刺状投射神经元中，研究人员观察到线粒体RNA (mtRNA)(一种强有力的线粒体衍生的天然免疫原)的释放，并同时发现刺状投射神经元中固有免疫信号的上调。此外，研究人员还发现释放的mtRNA能够直接连接固有免疫双链RNA感受器蛋白激酶R(PKR)，仅对线粒体功能的化学抑制(不存在mHTT)足以诱导人神经元PKR的表达。研究人员在本文中强调了考虑细胞类型特异性转录失调在HD发病机制中的重要性，并提出mHTT导致线粒体失调与引起固有抗病毒免疫信号触发的mtRNAs释放，进而导致HD中神经元的脆弱性增强的模型。
论文ID
原名：Cell Type-Specifific Transcriptomics Reveals that Mutant Huntingtin Leads to Mitochondrial RNA Release and Neuronal Innate Immune Activation
译名：细胞类型特异性转录组学揭示突变的亨廷顿蛋白导致线粒体RNA释放和神经元固有免疫激活
期刊：Neuron
IF：14.415
发表时间：2020年9月
通讯作者：Myriam Heiman
通讯作者单位：麻省理工学院脑与认知科学系
DOI号：10.1016/j.chemosphere.2020.126158
实验设计
结果
为了获取细胞类型特异性基因表达谱，研究人员运用了翻译核糖体亲和层析的方法探究了常用的鼠HD转基因与系列等位基因敲入HD模型。此外，研究人员还利用无偏见的单核RNA-seq探究了鼠常用HD模型与人2-4期HD的细胞类型特异性转录组改变（图1）。
图1 高密度脂蛋白和高密度脂蛋白小鼠模型的细胞类型特异性纹状体基因表达谱。
（常用的转基因R6/2外显子1 mHTT片段HD模型和等位基因系列敲除蛋白(Q20、Q50、Q111、Q170和zQ175DN) HD模型用于翻译核糖体亲和纯化(TRAP)图谱，该图谱通过免疫亲和纯化遗传确定细胞类型中的GFP标记的核糖体复合物来纯化成熟的细胞质定位的mRNAs。R6/2和zQ175DN模型也用于单核RNA测序(snRNA-seq)，其基于捕获的核序列报告基因表达变化。HD 2-4级患者和对照组尾状核和壳核(纹状体)组织样本也用于snRNA-seq。）
1 HD小鼠模型细胞类型特异性基因表达分析
为了描述HD中最容易受影响的细胞类型纹状体SPNs，以及与HD相关并提供大量兴奋性谷氨酸输入到纹状体的皮质纹状体投射神经元(CStrPNs)（图2A），研究人员在方法上选择了能在细胞类型群体水平上提供高分辨率并检测成熟mRNA的TRAP方法。模型上，研究人员选择了9月龄经典的HD模型(R6/2)鼠。研究人员先描述了差异基因在三种细胞类型发生的变化以及重叠相似程度。接着描述了差异基因在三种细报富集通路的情况(图2B-E)。最后，研究人员利用权基因共表达网络分析（WGCNA)的方式验证了模块基因共表达情况以及最显著的通路变化富集情况，并利用染色质富集分析(CHeA)进行了验证。
图2 通过TRAP对HD的R6/2模型中纹状体刺状投射神经元(SPNs)和皮质纹状体投射神经元(CStrPNs)进行基因表达变化的细胞类型特异性分析。A：iSPN、dSPN、CStrPNs的示意图 BC；R6/2三种细胞差异基因的数量变化以及相应的独特与重合的韦恩图 D：三种细胞的SPN Marker表达情况 E：R6/2中三种细胞类型的上调与下调的KEGG差异基因富集通路。研究人员发现针对于dSPN和iSPN，上调的差异基因主要富集于突触传导功能下调，上调的差异基因主要富集于DNA错配修复通路。CStrPN与iSPN类似，主要的区别集中在突触传递与昼夜节律传导途径。
2 通过TRAP对HD等位基因系列敲入模型的纹状体SPNs、星形胶质细胞和胆碱能中间神经元细胞进行基因表达变化的细胞类型特异性分析
为了将这些在转基因mHTT外显子1 R6/2模型中获得的数据扩展到HD的全长Htt模型，研究者选取了一系列具有mHTT等位基因的模型（伴随CAG的敲入）并于疾病进展的早期时间点进行检查。所有研究均基于6月，因为6月这个时间点基于全组织RNA测序研究的早期分子表型时间点，方法上研究者选择的是能检测成熟mRNA的TRAP方法。除描述iSPN与dSPN之外，还描述了星形胶质细胞与胆碱能中间神经元，因为星形胶质细胞与HD病理过程相关，而胆碱中间能神经元在HD中代表一群纹状体大量分布（图 3A）。为了鉴定SPN中CAG长度依赖性基因表达的变化，研究者对Q20、Q50、Q111、Q170和zQ175DN模型上述关注细胞类型基因表达变化进行线性回归分析，该分析揭示了数千个基因在dSPN和iSPN中的表达与CAG重复扩展的程度相关，dSPN具有更多的基因取代与ISPN相比，CAG长度依赖性失调。（图 3B）。接着对zQ175细胞特异性变化与已经发表的zQ175组织变化的测序数据进行富集当比较，发现SPN基因在iSPN与dSPN中均发生下调（图 3C）。zQ175与Q20在dSPN中，大约一半的基因失调也在iSPN中失调（图 3D）。在CAG长度依赖的基因表达变化中，dSPN和iSPN之间共享更多的下调（相对于上调）基因通路及预测调控因子（图 3E)。研究者进一步利用WGCNA与线性回归分析表明每个SPN细胞类型存在基因表达与CAG长度相关的基因模块。最终表明以上的细胞特异反应（OXPHOS）与细胞的非特异反应（昼夜节律与突触功能）将导致iSPN对mHTT更敏感。
图3 通过TRAP对HD等位基因系列敲入模型的纹状体SPNs、星形胶质细胞和胆碱能中间神经元细胞进行基因表达变化的细胞类型特异性分析。A：纹状体SPNs（iSPNs与dSPNs）、星形胶质细胞和胆碱能中间神经元细胞的示意图；BD：在不同HD模型与Q20插入HD模型中四种细胞类型差异基因上下调变化以及四种细胞之间的重复与独特基因韦恩图；C：对比差异基因在zQ175细胞TRAP数据与zQ175组织测序数据差异基因的变化；E：利用KEGG途径富集分析dSPN和iSPN中下调（左)和上调(右）基因以CAG长度依赖性变化的线性回归分析，结果表明在每个SPN细胞类型中，其基因表达与CAG长度相关。此外，dSPN与iSPN中存在共享基因通路。
3 HD小鼠模型细胞类型特异性基因表达谱的研究
为了证实和扩展TRAP细胞类型特异性研究结果，研究人员在R6/2和zQ175DN HD模型小鼠中进行了与TRAP研究相同年龄的纹状体细胞的snRNA-seq 。研究人员利用ACTIOnet进行聚类分析，发现了一类表达Foxp2/Olfm3的神经元亚群（图 4A、4B)。由于Foxp2能双向调节HD鼠的HD样表型，因此研究人员猜测这一新定义的亚群可能构成了这一调节作用。研究人员接着比较了HD模型鼠与对照鼠纹状体广泛分布的细胞差异基因，发现结果与TRAP研究类似，许多纹状体细胞类型低表达SPN标志基因，表明mHTT影响许多细胞共有的调控因子(图 4C、4D)。不同细胞类型和不同HD模型的DEGs比较表明，iSPN和dSPN对mHTT的外显子1片段与具有相同重复大小的全长敲入mHTT的反应非常相似（图 4E、4F)。研究人员接着比较了zQ175细胞与zQ175组织的RNAseq数据，发现SPN基因高度重叠但其它细胞类型的改变比较少(图 4G）。研究人员进一步对差异基因进行KEGG通路分析，发现snRNA-seq与TRAP揭示了相同的通路变化(图 4H）。针对snRNA-seq获取的结果，研究人员使用CheA框架网络分析得出Rarb、Foxp等可能的潜在调控因子。综上所述，研究人员的snRNA-seq数据证实了TRAP在小鼠模型中对dSPN和iSPN的发现，同时还确定了这两个小鼠模型之间的其他细胞类型之间存在不同的基因扰动。
图4 通过snRNA-Seq对HD的R6/2和zQ175DN模型中的纹状体细胞类型进行基因表达变化的细胞类型特异性分析。AB:15只小鼠HD模型注释细胞类型的二维Actionset图，7只R6/2模型小鼠和8个等基因对照，均为9周龄；CD：R6/2模型与对照(C)或zQ175DN与对照(D)相比，纹状体细胞类型差异基因变化最显著的上下调蛋白质编码基因；EF：SnRNA-seq识别细胞类型基因特异性(E)下调和(F)上调在小鼠模型中重叠的意义；G：鉴定zQ175DN细胞snRNA-seq和引用已发表的zQ175DN组织RNA-seq的下调和上调基因之间重叠的意义；HI：在R6/2(H)和zQ175DN(I)模型中，dSPN和iSPN中下调和上调基因的KEGG通路分析。
4 用HD的snRNA-Seq进行细胞类型特异性基因表达分析
为了将这些HD模型研究扩展到人HD尾状细胞和壳核细胞（纹状体)，研究人员进一步对2-4级人HD的尾状细胞和壳核细胞进行了snRNA-seq研究，并与对照组尾状细胞和壳核细胞进行了比对。对表达基因的聚类分析结果表明人HD存在鼠HD模型常见的细胞类型，人尾状和壳核样品中存在更为罕见的细胞类型(图 5A）。人HD尾端和壳核与对照组SPN相比，dSPNs和iSPNs呈现不太明显的SPN亚型。随着人HD分级的上升，dSPN数量增加，iSPN数量减少，与已发表的人HD增强iSPN脆弱性的研究相符（图 5B）。接着，研究人员比较了HD组与对照组尾状核和壳核所有足够丰富的细胞类型的基因表达，揭示了神经元和胶质细胞以及内皮细胞与壁细胞的DEGS，星形胶质细胞标记基因在星形胶质细胞中的差异表达存在于人HD的不同等级，而不存在于小鼠HD模型（图 5C-5E）。差异基因的数据分析还揭示了人HD的iSPN与dSPN存在mtRAN广泛上调，而在鼠的HD模型中，mtRNA的上调与鼠的CAG长度依赖性相关(图 5F）。最后，研究人员对人HD的差异基因进行了KEGG通路富集分析，发现iSPN与dSPN中的许多差异表达基因与突触功能相关（图 5G）。利用ChEA转录调节因子的分析表明，Kdm5b、Crem、Foxo3和Vdr是潜在的主调节因子之一，这种结果在TRPA中被验证（图 5H）。
图5 通过snRNA-Seq对对照组和人HD死后组组织中尾状核和壳核细胞类型进行基因表达变化的细胞类型特异性分析。A：对照和HD样本中收集细胞类型的二维Actionet；图 B：相对于对照样本，不同等级HD的dSPN与iSPN的占比；C：人HD纹状体细胞最显著差异的5个上下调基因；D：鉴定纹状体细胞的snRNA-seq和引用已发表的纹状体组织RNA-seq的下调和上调基因之间重叠的意义；E：反应性星形胶质细胞标记基因在星形胶质细胞中的差异表达存在于人HD的不同等级，而非小鼠HD模型；F：通过snRNA-seq检测到人HD主要纹状体细胞类型的mtRNA上调，通过TRAP发现R6/2和zQ175DN小鼠模型mtRNA的上调；G：人HD上下调iSPN与dSPN差异基因的KEGG富集分析；H：通过CHEA分析预测在dSPN和iSPN中下调和上调的基因转录调节因子。
5 SPN中mtRNA的释放伴随着线粒体功能障碍
在HD snRNA-seq数据以及小鼠模型HD TRAP数据中，mtRNAs是最上调的基因之一，表明存在mtRNA释放现象。为了评估mtRNA的释放是否发生在更早的疾病模型时间点，而不是潜在的仅仅是后来的继发性现象，研究人员描述了在等位基因HD系列模型中3月龄的iSPN，结果表明即使是在3月龄也存在mtRNA的释放。为了探究mtRNA释放的原因，研究人员比对了R6/2与zQ175的TRAP数据，发现iSPN中OXPHOS通路的一些主成分基因发生显著变化（图 6A）。此外，研究人员还证实了这种基因表达的减少导致OXPHOS功能活性从年龄匹配的小鼠模型的组织减少（图 6B）。为了考虑其他线粒体相关的途径，可能是mtRNA释放的无偏方式，研究人员进一步进行了WGCNA分析的3个月和6个月的细胞类型特异性等位基因系列TRAP iSPN数据，发现下调的CAG长度依赖的方式与模型年龄相关。基于这些发现，研究人员进一步研究了人类snRNA-seq数据中OXPHOS mrna的表达，也观察到许多OXPHOS mrna的下调（图 6C）。这种与模型年龄的关联（从早期的3个月的疾病模型时间点开始）进一步表明mtRNA释放和减少OXPHOS基因表达之间的机制联系。
图6 线粒体氧化磷酸化途径mRNA在R6/2和zQ75DN模型以及HD组织的SPN中被下调。A：OXPHOS组分复合物的示意图以及OXPHOS组分mRNAs在9周龄或6月龄zQ175DN的dSPNs或iSPNs中的变化热图(与Q20对照相比)；B：9周龄时，整个R6/2组织中测量OXPHOS复合物I的活性（顶部：纹状体；底部：海马对照）；C：人HD组织的dSPN或iSPN中OXPHOS组分mRNAs表达改变热图
6 mHTT激活PKR介导的先天免疫途径
由于细胞质中的mtRNAs已被证明是细胞质固有免疫传感器的高度免疫原性触发器，能够激活人细胞中的I型干扰素反应，因此研究人员检测了固有免疫信号通路在iSPN中是否上调。许多干扰素应答基因在iSPN中被选择性上调，iSPN的mtRNA释放最高(图 7A、7B）。由于PKR最近被证明是内源性释放胞浆mtRNAs的传感器，研究人员进一步证实了HD模型纹状体组织中PKR的表达与激活。在R6/2和ZQ175DN基因敲入小鼠中，纹状体组织中PKR不仅蛋白表达水平上调并且磷酸化增加（图 7C、7D）。通过免疫荧光染色，研究人员发现在对照组织中，PKR的基本表达仅在非神经元细胞中被观察到(如之前报道的推测为胶质细胞)，但在HD模型中，PKR也可以在神经元细胞中被检测到（图 7E）。研究人员进一步利用PKR纯化的方法，发现在mHTT存在的情况下mtRNAs与PKR结合（图 7F）。为了进一步评估线粒体OXPHOS活性本身的抑制是否也会导致PKR的表达，研究人员探究了在没有mHTT的情况下，线粒体复合物I、复合物II和复合物Ⅲ的抑制对于正常(非HD)神经元的影响。与对照处理组相比，复合物I、II和III抑制诱导PKR的表达，在无糖培养基中培养可加重复合物I和II抑制的作用（图 7G)。这些数据总体表明，直接化学抑制人神经元线粒体OXPHOS的活性也可诱导PKR表达，类似于TRAP所揭示的mHTT对OXPHOS表达的遗传效应（图 7H）。
图7. PKR介导的先天免疫途径被mHTT激活。A：自身TRAP数据中，与固有免疫信号相关的已知干扰素刺激基因与抗病毒信号因子的表达热图；B：ELISA检测纹状体组织干扰素表达：R6/2模型9周龄（左面板）或ZQ175DN模型23个月龄（右面板）；CD：对9周龄的R6/2模型（左面板）或23月龄的zQ175DN模型（右面板）整个纹状体组织中PKR水平以及PKR磷酸化程度的Westernblot分析；E：对9周龄的R6/2和等位基因对照组纹状体的NeuN（红色伪彩色）、总PKR（绿色伪彩色）和DAPI（蓝色伪彩色）间接免疫荧光染色；F：从R6/2或等位基因对照组纹状体胞浆提取物中免疫纯化PKR后进行与PKR相关的mtRNA的定量PCR。G：在体外培养的14天IPSC衍生的人神经元中用DMSO载体对照、30mg/mL干扰素-β(已知诱导PKR阳性的对照处理组)或线粒体氧化磷酸化抑制剂以增加对OXPHOS功能的依赖
结论
本文从特异性细胞转录组变化方面研究了突变的亨廷顿蛋白（mHTT）在HD中对神经元细胞死亡的影响，发现HD最脆弱的纹状体刺状投射神经元中释放线粒体RNA (mtRNA)(一种强有力的线粒体衍生的天然免疫原)，刺状投射神经元中固有免疫信号上调。此外，研究人员还发现释放的mtRNA能够直接连接固有免疫双链RNA感受器蛋白激酶R(PKR)，仅通过对线粒体功能的化学抑制(不存在mHTT)也足以诱导人神经元PKR的表达。研究人员在本文强调了考虑细胞类型特异性转录失调在HD发病机制中的重要性，并提出了mHTT导致线粒体失调与mHTT触发mtRNAs释放引起固有免疫信号激活，进而导致HD神经元脆弱性增强的模型。
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