科研 |SCI REP-UK:RNA测序和全基因组重测序阐明西瓜-白粉病互作的抗药性信号并鉴定抗白粉病定位位点（ClaPMR2）
编译：夕夕，编辑：景行、江舜尧。
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西瓜是一种重要的蔬菜作物，在美国已被广泛种植，全球产量约为1亿吨。白粉病菌引起的白粉病（PM）是西瓜主要生产限制因素。美国农业部在南卡罗来纳州查尔斯顿开发了许多PM和多重抗病（MDR）西瓜种质系。为了更好地了解白粉病-西瓜相互作用中涉及的先天和活化分子防御机制，研究者对易感(USVL677-PMS) 和抗性(USVL531-MDR) 西瓜接种黄单胞菌，在接种后0，1，3和8天收集叶片进行RNA-seq分析，共鉴定到2566个差异表达基因（DEG）。此外，对USVL531-PMR，USVL677-PMS和四个渗入的PM抗性重组近交系（RIL，USVL531-PMR×USVL677-PMS）进行了比较全基因组重测序分析，以鉴定SNP和InDels。基于SNP鉴定和CAPS标记，鉴定ClaPMR2为抗性基因。Citrullus lanatus PM抗性基因2，是一种与拟南芥pM具有同源性的NBS-LRR抗性蛋白（R），抗性蛋白RPW8。转录组数据还揭示了与pM抗性R蛋白（R基因）介导的渗入连接相关的复杂调控网络，该调控网络可能涉及多个信号调节剂和换能器，碳水化合物代谢，细胞壁修饰和激素信号通路。
论文ID
原名：Elucidation of resistance signaling and identification of powdery mildew resistant mapping loci (ClaPMR2) during watermelon‐Podosphaera xanthii interaction using RnA‐Seq and whole-genome resequencing approach
译名：RNA测序和全基因组重测序阐明西瓜-白粉病互作的抗药性信号并鉴定抗白粉病定位位点（ClaPMR2）
期刊：Scientific Reports
IF：3.998
发表时间：2020年8月
通讯作者：Mihir Kumar Mandal
通讯作者单位：美国蔬菜实验室
DOI号：10.1038/s41598-020-70932-z
实验设计
结果
1 USVL531-MDR（R）和USVL677-PMS（S）对白粉病接种反应
为了比较USVL531-MDR（抗性）和USVL677-PMS（易感）西瓜系之间PM诱发的特征性疾病症状，研究者进行了显微镜观察，观察接种八天时间中，分生孢子萌发对菌丝发育和增殖的影响。图1A展示了从接种0h，24h，72h和8 d pi叶片的变化。USVL531-MDR和USVL677-PMS在PM接种时间（0小时至8 DPI）之间存在显着差异。与USVL677-PMS相比，USVL531-MDR对白粉病菌引起的PM表现出较高的抵抗力。接种后72小时，在USVL677-PMS上观察到分生孢子链，而在抗性植株上未观察到疾病症状。在8 DPI时，与USVL677-PMS相比，USVL531-MDR的下胚轴，子叶和真叶继续表现出对PM的抗性，在USVL677-PMS上观察到PM生长并且分生孢子变多（图1A-C）。通过显微镜观察USVL531-MDR和USVL677-PMS表皮细胞内锥虫蓝染色的PM病原体随时间变化（0小时至8 DPI），与USVL677-PMS相比，USVL531-MDR的叶片显示分生孢子萌发和菌丝生长明显减少（图1B,C）。在USVL677-PMS上，分生孢子能够发芽，在24小时内形成附生和次级菌丝，而在抗性系中未观察到附生或分生孢子的萌发。此外，与USVL531-MDR（PM抗性谱线）相比，在接种8天时下观察到USVL677-PMS中白粉病菌的转录本水平显着增加（图1D）。
图1.USVL531-MDR和USVL677-PMS西瓜品种PM感染过程
2 抗性（USVL531-MDR）和易感（USVL677-PMS）之间植物防御信号网络的转录组重编程
对抗性和易感西瓜品种接种白粉病菌0h，24h，72h和8天后取西瓜叶片进行转录组测序分析（RNA-seq）。每个样本产生约90M-160M的reads，比对效率在77%-91%，测序深度在19X-25X（图2A）,共鉴定到了3770个差异表达基因（DEG），其中2566个是唯一表达（图2B,C）。在72小时和8DPI时，白粉病菌感染的宿主基因型效应（USVL531-MDR与USVL677-PMS）更加清晰。与未接种的对照植物相比，在PM接种的USVL531-MDR中有681个基因差异表达，而在易感染的USVL677-PMS植物中，在72小时时只有191个基因差异表达。在后期感染过程（8DPI）中观察到相反的PM反应，PM生长严重，与USVL531-MDR相比，具有1762个DEG的USVL677-PMS植物发生次级菌丝体大量发育。热图（图3A）和维恩图（图3B）分析了PM接种的抗药性USVL531-MDR和易感性USVL677-PMS之间唯一的2566个DEG，发现每种基因型对PM感染期间的转录变化均具有独特的影响。
图2.RNA-seq数据
此外，对这2566个DEG进行GO分析（图3C,D）。有趣的是，观察到有27个基因调控基因表达，为PM致病周期的关键因素提供了证据。
根据热图和韦恩图（图3A,B）中对2566个DEG分析发现，在USVL677-PMS感染白粉病菌时，其中有939个上调表达基因和823个下调表达基因，并对这些差异表达基因进行GO注释，共分为生物学过程（BP），分子功能（MF）和细胞组分（CC）三类。
图3.2566个DEG的表达水平和GO注释
在BP中，8DPI的差异表达基因主要富集在应激反应，非生物刺激反应，内源性刺激反应，细胞组分组成和生物刺激反应等功能。在MF中，主要富集在结合，催化活性，蛋白质结合，转录酶活性和水解酶活性等功能。在CC中，主要富集在细胞，细胞组分，细胞质等功能。
随后，对这些差异表达基因进行KEGG通路注释，分别有93条上调表达通路和101条下调表达通路，主要包括代谢途径，次生代谢产物生物合成，植物-病原体相互作用，植物激素信号转到等通路。然而，在比较易感和抗性的差异表达基因富集的KEGG通路中，发现TCA循环相关的代谢途径是最显著富集的通路，此外，还发现真菌PAMP（Avr9）上调CDPKs， Cla017196，促分裂原活化蛋白激酶和WRKY转录因子的上调，这些物质调节USVL531- MDR对白粉病菌的感染。但是，研究人员观察到RPM1相互作用蛋白4（RIN4，Cla014936），Cla001497，Cla015191，Cla013424，钙调蛋白和钙依赖性蛋白激酶作为调节白粉病和USVL677-PMS相互作用相关的信号转导事件的主要参与者。
对USVL531-MDR和USVL677-PMS之间的2,566种独特DEG的比较分析表明，大多数DEG参与了与细胞过程，单一生物过程，代谢过程相关的生物过程以及对刺激的反应（图4A）。就分子功能而言，大多数DEGs具有细胞蛋白，细胞器和膜蛋白，分别根据结合和催化活性功能。
图4. USVL531-MDR和USVL677-PMS之间2566个独特DEG的比较分布
在感染过程中，所有样本中所有上调的2142个DEG和下调的1628个DEG的进一步比较，结果显示，某些激素，MAP激酶，Ca2 +介导的信号通路基因和许多应激反应基因被共同调节（图4B）。结果表明，在PM感染和压迫感形成的早期阶段，很少有DEG被激活。此外，结果表明，在抗性和活化植株中，基础防御反应基因存在重叠。所有这些表明植物通过激活一系列相似的防御机制来响应病原体的入侵。另外，在分生孢子萌发的早期，PMVL病原体与宿主之间的宿主特异性相互作用在USVL531-MDR和USVL677-PMS之间发生，并且在感染的早期，受影响的DEGs决定了两个品种之间的抗药性或敏感性。
先前的研究集中在众所周知的上游信号传导途径，但本研究的转录组学研究提供了抗性和易感植株下游调节的详细信息（图5和6）。根据抗性植株的表达特征分析，大多数诱导的防御途径基因主要参与代谢过程和并具有分子功能蛋白结合。 为了响应白粉病菌的相互作用，在抗性和易感植株中，TIR-NBS-LRR和CC-NBS-LRR等几种抗性蛋白的表达也发生了显着变化。
图5. USVL531-MDR在（A）24小时（B）72小时和（C）8 dpi时涉及生物过程，分子功能和细胞成分的上调差异表达转录本/基因（DEG）的分布
图6. USVL677-PMS中（A）24小时（B）72小时和（C）8 dpi时涉及生物学过程，分子功能和细胞成分的上调差异表达转录本/基因（DEG）的分布
为了研究与USVL531-MDR相关的防御机制，研究者对USVL531-MDR中与生物学过程，分子功能和细胞成分有关的上调DEG的分布与USVL677-M中下调的DEG的分布进行了比较分析（图7A）。观察到80278152基因在24h，72h，8DPI时上调表达。在USVL531-MDR中，发现在感染24h、72h、8DPI期间观察到了与31个基因相关的共同诱导的防御信号通路。在USVL677-PMS中在感染24h、72h、8DPI中有13个共有的下调差异表达基因。在USVL531-MDR中，三个基因（Cla018352，Cla016180，Cla007029）通常在8DPI上调，而在USVL677-PMS中的所有时间点均下调。对差异表达基因进行GO注释，在50个显著富集的GO term中，与应激反应相关的term在易感和抗性植株中富集程度最高（图7B），除了蛋白质结合和水解酶，研究人员还观察到其他防御调节基因的差异表达，例如与DNA结合相关的基因，转录因子，信号转导活性，受体活性和受体结合（图7C）。此外，还发现大多数DEGs编码质体，质膜，核，膜和胞质蛋白（图7D）。
图7.接种PMVL后与USVL677-PMS中下调的DEGs相比，USVL531-MDR中涉及生物过程，分子功能和细胞成分的上调DEG分布的比较分析
3 西瓜中PM抗性基因座的分子定位
由USVL531-MDR×USVL677-PMS杂交形成的4条红色的抗PM肉红色RIL渗入系（R-201，R-202，R-203和R-204），在5代中没有可见的PM症状。对其进行全基因组重测序，将测序reads与参考基因组进行比对以鉴定SNP和InDel。测序结果见表1。与西瓜参考基因组97103进行比对在USVL531-MDR，USVL677-PMS，R-201，R-202，R-203和R204中，总共鉴定出492103、264170、331733、335950、286536和299279个SNP，以及129546、74113、79916、81830、72828和75021个InDel。与USVL531-MDR比对，在USVL677-PMS，R-201，R-202，R-203和R-204中鉴定出总共421727、406136、499575、459749、453138个SNP以及99507、115292、127136、120748和120171 InDel。但是与USVL677-PMS比对，发现SNP和InDel数量均减少（表2和表3）。
表1.全基因组测序数据总结
表2.USVL531-PMR，USVL677-PMS，R-201，R-202，R-203，R-204和西瓜参考基因组97103之间比较SNP分析结果
表3.在USVL531-PMR，USVL677-PMS，R-201，R-202，R-203，R-204和西瓜参考基因组97103之间进行INDEL分析结果
前人的研究表明可能存在多种具有白粉病抗性的SNP，其中有12个位于2号染色体的SNP和位于1号染色体，3号染色体，4号染色体，7号染色体，8号染色体，9号染色体和10号染色体的12个SNP。对来自多病抗性品系USVL531-MDR的四个RIL品系渗入纯合SNPs和InDels的比较分析，使研究人员能够鉴定具有与2号染色体上PM抗性相关的潜在基因/等位基因的单个基因组区域。通常，植物对真菌病原体的抗性需要通过植物抗性蛋白（R）来识别AVR的蛋白，从而激活抗病性反应。本研究基于包含整个西瓜基因组序列的注释基因/蛋白质序列，鉴定了57种候选NBS-LRR抗性蛋白质。此外，通过利用拟南芥和甘蓝型油菜的保守氨基酸序列相似性，在西瓜中鉴定了Mlo同源的14个基因。绘制了西瓜基因组Citrullus lanatus亚种中所有NBS和Mlo样蛋白的位置。并鉴定了染色体2基因组中的10个NBS-LRR和2个Mlo基因（图8）。对西瓜品系的七个NBS-LRR基因（USVL531-MDR，USVL677-PMS，R-201，R-202，R-203和R-204）的每个基因组进行比较基因组序列分析，从而鉴定出从USVL531-MDR到RIL系中的纯合SNP。其中一个NBS-LRR蛋白Cla019831增加了USVL531-MDR感染8天时的转录水平。研究人员比较了Cla019831与AtRPW8.1和AtRPW8.2结构域之间的序列相似性（图9A，B），并得到40-44％的保守性（图9A，B）。序列在RPW8域中的序列同一性，进一步得到3D建模的支持，拟南芥（AtRPW8.1）的RPW8域与西瓜的N-末端域Cla-RPW8（USVL531-MDR）结构重叠。与抗性相比，在核苷酸位置＃84（GA; Arg-Arg），＃1474（CT; Arg-STOP），＃1818（AG; Arg-Val），＃2607（TA; Ser-Arg）的核苷酸位置观察到四个SNP。基于SNP的鉴定，设计了基于PCR的CAPS（裂解的扩增多态序列）标记，用于1474位替换位的Arg-STOP密码子（并带有适当的酶切位点，以对亲代USVL531- MDR和USVL677-PMS以及抗PM渗入线：R-201，R-202，R-203和R-204（图10A）。与易感株USVL677-PMS相比，CAPS标记ClaPMR2与USVL531-MDR，R-201，R-202，R-203和R-204中的抗性基因座共分离（图10B）。根据F2种群的表型筛选，发现耐药位点是一个主导基因。基于CAPS标记分析的PM疾病指数评分，从F2种群中选择了20种具有独特抗性的植物和20种具有易感表型的植物。抗性植株在0–10等级上被评定为<1，易感植物被评定为> 8。由于抗性表型占优势，因此研究者在所有测试的20个品系中观察到了ClaPMR2基因座，与具有PM抗性的杂合子和纯合子个体中的抗性基因座完全共隔离（图10C）。
图8.Circos图显示了PM抗性渗入系中SNP，InDels，NBS-LRR和Mlo基因的分布
图9.西瓜ClaPMR2的预测二级结构
图10.SNP使用电泳在亲本，F2和RIL渗入西瓜系上获得CAPS验证
所有分离株均在USVL677-PMS上生长并产生分生孢子，而USVL531-MDR对所有分离株均具有耐药性，支持了作者的假设，即USVL531-MDR中功能性ClaPMR2对类似于AtRPW8的广泛PM分离株具有耐药性。迄今为止，还没有将抗性基因定位到西瓜中的PM抗性。值得注意的是，这是首次将F2育种种群与转录组学和基因组重测序技术相结合，用于定位和筛选西瓜PM抗性基因的候选基因。这项研究对于利用ClaPMR2基因作为西瓜的PM抗性标记对ClaPMR2的克隆和抗性育种具有重要价值。此外，研究者提出了一种响应西瓜白粉病相互作用的ClaPMR2介导的西瓜抗性信号传导模型。
图11.ClaPMR2介导的西瓜抗白粉病抗性信号转导模型
讨论
白粉病菌（Podosphaera xanthii）引起的白粉病（PM）是许多蔬菜作物（包括西瓜和葫芦科）上的常见和最具破坏性的病原体之一。 由于子叶，真叶，叶柄和茎上的白色分生孢子生长，它可以限制植物的光合作用，从而导致叶片过早丧失，进而影响果实品质和产量。杀菌剂和抗性品种是控制PM的主要手段。但是，杀菌剂价格昂贵，对环境不友好，通常会导致对特定杀菌剂不敏感/耐药的竞争。 实验室最近的研究表明，应用环境友好型免疫诱导剂褪黑激素可以增强西瓜和其他葫芦类作物中植物的免疫力并抑制病原体的生长。为了增强商品栽培西瓜品系的抗性育种，在PM易感性和抗性过程中鉴定主要基因调控子很重要。 在本研究中，通过在USVL677-PMS（PM易感，兼容）和USVL531-MDR（PM耐性）随时间变化的PM感染过程中的转录组学分析，提供了相容性和不相容性相互作用期间各种基因的差异调控的研究。USVL531-MDR在所有时间点均显示出对PM病原体的抗性增强，而USVL677-PMS的免疫力却受到损害，其中PM严重生长，在8DPI观察到胚轴在下胚轴，子叶和真叶上的大量生长。在本研究的表达数据中，对于抗性植株的860个上调的DEG，分子功能中最富集的GO术语是蛋白质结合（GO：0005515）和水解酶活性（GO：0016788）。先前的研究表明，在病原体识别中通常需要多个相互依赖的蛋白质关联，以在植物与病原体相互作用期间启动宿主介导的抗性信号传导。本研究鉴定出蛋白质，例如Cla019888，一种有丝分裂原激活的蛋白激酶激酶3； Cla016199，基本的螺旋-环-螺旋dna结合家族蛋白； Cla019156，疾病易感性增强1； Cla000815，富含半胱氨酸的rlk（受体样蛋白激酶）； Cla003005，snf1相关蛋白激酶； Cla023088，富含亮氨酸的受体样蛋白激酶家族蛋白在黄腐病原菌-USVL531-MDR相互作用期间具有信号转导性，并参与生物胁迫，从而为植物提供抵抗病原体的抗性。总体而言，这些发现将提供新的见识，以鉴定对PM抗性/敏感性敏感的重要基因/等位基因，并将作为开发微卫星/ SSR标记的遗传资源，用于分子育种计划以开发PM抗性西瓜。
此外，为了提高与对西瓜等非典型特产作物的PM抗性相关的新基因发现的效率，利用四个导入的RIL系进行了SNP和InDEL分析，并确定了与PM抗性有关的预测性ClaPMR2基因位点。这项研究的主要发现将有助于加快对西瓜和其他葫芦等特殊作物的抗黄腐病PM的育种。
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