科研│ INT J MOL SCI: 转录组学分析响应菌核盘菌的候选基因并克隆了桑树核盘菌诱导的几丁质酶基因（国人佳作）
编译：Nicole，编辑：景行、江舜尧。
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核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum, Ss）是一种植物病原真菌，可导致油菜的核盘菌茎腐病，并且对桑和许多其他农作物有害。野生桑树（Morus laevigata）对Ss表现出高抗性，但尚不清楚其抗性的分子机制。本文通过RNA-seq揭示了桑树对Ss侵染的转录组反应特征。Ss接种后的桑树叶片中共检测到833个差异表达基因（DEG）。经过GO术语和KEGG途径富集分析后，从上调的DEG中选择了42个抗性相关基因作为核心候选基因，发现其中的大多数（30/42）特异性地或主要地在花中表达，这与Ss主要通过花器官侵染植物这一事实相一致。在两个易感桑树品种中接种Ss后也诱导了这些候选基因，但是大多数情况下其诱导慢得多，程度也较低。基于42个候选基因的表达模式和功能注释，本文克隆了Ss诱导的几丁质酶家族（MlChi家族）的全长gDNA和cDNA序列。系统发育树的构建、蛋白质相互作用网络预测和基因表达分析揭示了它们在应对Ss侵染中的特殊作用。原核表达其蛋白质产物均呈包涵体形式存在。本研究结果将有助于了解桑树抗Ss的分子基础及开发MlChi基因的应用。
论文ID
原名：Transcriptomic Analysis Reveals Candidate Genes Responsive to Sclerotinia scleroterum and Cloning of the Ss-Inducible Chitinase Genes in Morus laevigata
译名：转录组学分析响应菌核盘菌的候选基因并克隆了桑树核盘菌诱导的几丁质酶基因
期刊：International Journal of Molecular Sciences
IF：4.556
发表时间：2020年11月
通讯作者：柴友荣
通讯作者单位：西南大学
DOI号：10.3390/ijms21218358
实验设计
结果
1 RNA-seq和转录组从头组装
在这项研究中，构建了两个RNA-seq文库（ML_SS0和ML_SS1），使用Illumina HiSeq2500平台进行RNA-seq测序，分别获得了2598万个和2502万个过滤的reads，Trinity软件从头进行了组装。最终共组装了91,166个转录物和61,985个单基因，单基因的平均长度为784 bp，N50为1487 bp（图1A）。
2 编码蛋白的基因的功能注释
使用BLAST算法对所有编码蛋白的基因进行注释。结果显示在Nr、Nt、KEGG、Swiss-Prot、PFAM、GO和KOG数据库中分别注释了27,991（45.15％）、14,341（23.13％）、7258（11.7％）、18,506（29.85％）、18463（29.78％）、19030（30.7％）和9779（15.77％）个可编码蛋白质的基因（表1）。在7个数据库中，总共注释了3804个可编码蛋白质的基因。桑树与川桑M. notabilis（75.0％）的匹配度最高，其次是葡萄Vitis vinifera（5.3％），红梅Prunus mume（1.9％），巴旦木Prunus persica（1.7％）和可可树Theobroma cacao（1.2％）（图1B）。
表1.带注释的可编码基因的统计分析。
3 差异表达基因的分析
在两个文库中总共鉴定出47,029个常见可编码基因（图2A）。使用FPKM进行归一化，并通过DESeq检测发现总共833个差异表达基因（DEG）（在ML_SS1中上调624个，下调209个）（图2B）。然后，对DEG进行GO和KEGG富集。对于GO富集，大多数DEG都富集了生物过程（BP）和分子功能（MF）GO类别。氧化还原过程（GO：0055114）、单生物体代谢过程（GO：0044710）和代谢过程（GO：0008152）在BP类别中最丰富，氧化还原酶活性（GO：0016491）、内肽酶抑制剂活性（GO：0004866）和内肽酶调节剂活性（GO：0061135）是MF类别中最显着富集的GO术语。对于KEGG分析，在217条KEGG途径中富集了833个DEG，图3显示了富集程度最高的20个途径。在前20个途径中，光合生物中的碳固定、半乳糖代谢、糖酵解/糖异生、氮代谢和碳代谢显着丰富，分别包括14、9、14、7和22个DEG。
图3. DEG富集的前20个KEGG途径。
4 候选基因筛选
根据生物学途径的描述，选择了与疾病抗性过程密切相关的几种途径，例如氧化还原过程、蛋白质磷酸化和蛋白水解、代谢过程以及转录因子和几丁质代谢过程。根据这些生物途径中DEG的表达水平，共选择42种上调的DEG作为候选基因，以应对Ss侵染（表2）。这些候选基因参与内肽酶、氧化还原酶、葡萄糖代谢、氮代谢、发病相关蛋白和转录因子。使用qRT-PCR验证了表达水平，结果表明38个基因的表达趋势与RNA-seq一致，只有4个基因（c30732_g1、c35494_g1、c40703_g1和c45307_g1）具有表达趋势不一致。上述38个基因，在SPSS软件的两个平台下使用Pearson相关性检测它们的表达相关性，结果显示它们之间的相关性达到了显着水平（r = 0.459，n = 38，p = 0.004）（图4）。
表2.从差异表达基因中筛选出的42个候选基因。
5 候选基因表达模式的器官特异性
使用qRT-PCR检测根、茎、叶、花和果实中42个候选基因的表达模式，其中大多数显示组织特异性表达模式（图5）。例如，c30732特别在根中表达，c46262和c42874主要在茎中表达，c36895、c42297、c36015和c42529在叶片中高表达，而c38165、c49683、c47088和c47127主要在果实中表达。有趣的是，大多数候选基因（30/42）在花中特异表达或主要表达。
6 候选基因在抗性品种及Ss诱导下的表达模式
使用qRT-PCR检测了42种候选基因在不同抗性桑树中对核盘菌侵染的响应。首先，分析了3个品种在侵染后不同时期的混合样品中候选基因的表达水平（图6A）。不出所料，侵染后三个品种中几乎所有基因都被上调，但是它们的表达程度因为品种抗性存在不同。例如，c45307、c23623、c34352、c47334、c36895、c43476、c38165、c40192、c37744、c49683、c30412、c46798、 c47127、c47511、c44653、c31798、c42874、c41666和c42162在桑树M1（对Ss具有高抗性）中高度表达，而c46262、c40595、c47088、c40703、c40199、c41475、c35494、c35789、c36313、c38466、c42297和c43119主要在桑树JL（部分抗Ss）中引起。然而，它们在Ma（对Ss低抗性）中的诱导强度低于在M1和JL中的诱导强度。然后，检测了3种抗性品种在不同侵染时期中42种候选基因的表达。如图6B所示，大多数基因在M1中被明显诱导，并在侵染后3小时达到峰值。其中的一半以上在JL或Ma中也显示出一定的诱导性，但是峰值表达比M1晚得多（例如，侵染后48小时）。
7 Ss诱导桑树几丁质酶基因的克隆和分子特征
在42个候选基因中，根据功能注释c36895、c42297、c46612、c46798、c34352、c36015和c42529是几丁质酶基因。基于与其他物种中几丁质酶基因的同源性，它们分别被重命名为MlChiIV、MlHEL、MlChiIA、MlChiV、MlChiIB、MlChiIC和MlChiID。进一步从桑树中克隆了这7个几丁质酶基因的全长cDNA和相应的gDNA序列，获得了总共15个同源序列用于随后的分析。序列比对发现M1ChiIC1与M1ChiIC2非常相似，而M1ChiV2-1和M1ChiV2-2分别与M1ChiV1-2和M1ChiV1-2非常相似，可以从杂合的等位基因对中克隆。由于非常高的同源性，无法通过单独的PCR进行克隆。仅获得了MlChiIC2、MlChiV1-2和MlChiV1-2的gDNA，而尚未获得MlChiIC1、M1ChiV2-1和M1ChiV2-2的gDNA。如表3所示，除了M1ChiIC1、M1ChiV2-1和M1ChiV2-2没有获得gDNA序列外，这15个基因的gDNA长度在1284bp（MlHEL2）至3603bp（M1ChiV1-2），cDNA长度在753 bp（MlHEL）至1332 bp（M1ChiIV2）。编码蛋白的氨基酸残基数目在144（MlHEL）至390（M1ChiV2），相对分子量在15.75至43.57 kDa，等电点（pI）在4.62至6.84，都是亲水蛋白。另外，信号肽预测表明其均具有信号肽。保守的域分析显示，MlChiIA、MlChiIB和MlChiIV包含Chitin_bind_1域（PF00187）和Glyco_hydro_19域（PF00182），MlChiV具有Glyco_hydro_18域（PF00704），MlChiID具有Chitin_bind_1域和Barwin域（PF00967），MlChiIC和MlHEL分别具有Chitin_bind_1域和Barwin域，仅包含Glyco_hydro_19域和Barwin域。亚细胞定位预测表明，除了位于细胞壁中的M1ChiV和M1HEL，其他大多数位于液泡中。
外显子/内含子分析表明，除了具有2个内含子的MlChiIA和MlChiIC之外，其他所有都只有一个内含子。系统发育分析表明，它们可以分为4类。如图7所示，根据几丁质酶基因家族在桑树和拟南芥中的进化关系，这些几丁质酶可分为五类（I、II、III、IV和V类）。本研究中15个几丁质酶分别属于I类（MlChiIA、MlChiIC1和MlChiIC2），II类（MlChiID1、MlChiID2、MlHEL1和MlHEL2），IV类（MlChiIB、MlChiIV1、MlChiIV2和MlChiIV3）和V类（M1ChiV1-1、M1ChiV1-2、M1ChiV2-1和M1ChiV2-2）。在拟南芥属关联模型的STRING数据库中研究了几丁质酶蛋白的功能相互作用。正交分析表明，M1ChiIV1、M1ChiIV2、M1ChiIV3和M1ChiIB与EP3蛋白同源。MlChiIA、MlChiIC1和MlChiIC2与HCHIB蛋白同源。M1ChiV1-1、M1ChiV1-2、M1ChiV2-1和M1ChiV2-2与Chi蛋白同源。M1HEL1、M1HEL2、M1ChiID1和M1ChiID2与拟南芥的PR4蛋白同源。最后，在拟南芥中预测了总共66个相互作用蛋白对。M1ChiIA/M1ChiIC和M1ChiV具有比M1ChiIV/M1ChiIB和M1HEL/M1ChiID更多的相互作用蛋白，这四类蛋白也显示出不同程度的相互作用。此外，GO富集分析表明，预测的相互作用蛋白在防御反应、免疫反应、对外部刺激的反应、系统获得性耐药、几丁质结合和几丁质酶活性方面显着富集。
表3.本研究得到的15个MlChi基因的特征。
图7.不同植物中几丁质酶的系统发育分析。使用NJ方法利用MEGA6.0构建系统发育树并使用iTOL（https://itol.embl.de/）在线工具将其可视化。
8 Ss诱导桑树几丁质酶基因的原核表达
在大肠杆菌BL21（DE 3.0）中原核表达15种几丁质酶蛋白。通过0.5 mM IPTG的诱导可以检测到所有重组蛋白，并且重组蛋白的分子量与其理论值一致（表3）。但是，所有表达的蛋白只能在沉淀中检测到，而不能从上清液中检测到，表明它们被表达为包涵体。考虑到包涵体蛋白通常是无活性的，没有进行纯化和酶活性检测。
讨论
本研究通过RNA-seq揭示了抗Ss的桑树在被Ss侵染后的转录组响应。总共有833个基因在侵染后差异表达。DEGs分析显示，其中大多数（74.9％）被上调，这意味着参与了桑树对Ss的抗性。与之前的研究一致，这些DEGs主要参与氧化还原过程和代谢过程。这些结果为探索抗Ss候选基因提供了可能性。转录变化是植物对病原体入侵做出反应的一种方式，尤其是在此过程中可以显着诱导的某些防御基因的表达。因此，从上调的DEGs中选择了42个抗性相关基因作为主要候选基因。功能注释表明，它们大多数编码酶，例如转移酶、还原酶、氧化酶和激酶。据报道，这些酶在不同植物中对包括Ss在内的病原体侵染的防御反应中起重要作用。其中一些编码转录因子，包括MYB、NAC、ETR、TGA和WRKY。先前的研究表明，这些转录因子通过控制代谢物的合成并影响激素信号，例如水杨酸（SA）、茉莉酸（JA）和脱落酸（ABA）信号，在植物对病原体胁迫的反应中起作用。另外，在候选基因中有7个编码几丁质酶的基因（c36895、c42297、c46612、c46798、c34352、c36015和c42529）。几丁质酶通常被称为是植物中与病程相关的蛋白质，可以通过细胞壁消化抑制病原真菌的生长，还可以在宿主植物中诱导进一步的防御反应。在例如烟草、大豆、油菜籽、水稻和茶树等植物中已通过生物技术广泛用于改善植物对病原体的抗性。
为了进一步探讨其在应对Ss侵染中的作用，本文分析了在桑树的不同器官中的表达特征。在植物中，Ss主要在非花器官如茎、长角果、荚果和果实中引起病变（腐烂症状），花瓣是最容易侵染的器官。结果表明其中的大多数（30/42）都是特定于花朵或主要在花朵中表达，这与Ss主要通过花器官（尤其是花瓣）侵染植物这一事实相吻合。这种现象还表明，病原体接种在异位器官上可以诱导抗Ss基因。这可能是桑树抵抗Ss的原因之一。然后，本文还比较并分析了42种候选基因在不同桑树抗性种群中对Ss侵染的响应。所有这些基因都是在高抗性桑树中快速诱导的，而具有部分或低抗性的两种品种中，大多数基因也是由Ss侵染诱导的，但响应速度慢得多，程度通常较低。在桑树中，这些基因大多数在侵染后3小时显着上调。在低抗品种Ma和部分抗性品种JL中这些基因在接种后48小时显着上调。一般而言，对病原体入侵和抗性的响应差异通常取决于其自身植物防御系统识别和激活时间的差异。如果植物能够快速识别病原体，传递信号并启动防御反应，那么它们将在与病原体的相互作用中显示出抗性。否则，植物将受到影响。因此，这些候选基因的响应差异与桑树品种的抗性有关，这表明这些候选基因的差异表达起着重要的作用。
在这42个主要候选基因中几丁质酶基因占最大比例，因此对其进行了克隆和进一步研究。几丁质酶可能降解几丁质，几丁质是真菌细胞壁的主要结构成分，导致细胞壁降解并致病菌死亡。在本文的研究中发现7个Ss诱导的几丁质酶基因全部在叶子或花朵中特别表达，并且是由Ss侵染诱导的。此外，在桑树侵染早期，表达水平比另外两种更易感的品种表达水平高（图6）。这些结果表明，几丁质酶在对Ss侵染的应答中起主要作用。因此，本文对这些Ss诱导的几丁质酶基因进行了克隆和序列分析。本文的研究结果表明，从桑树中分离到的Ss诱导的几丁质酶基因具有典型的几丁质酶特性，例如相对较小的分子量、较少的内含子和保守的结构域，主要位于分泌途径中，这些也表明了其功能的保守性。几丁质酶基因可以对不同植物中各种病原体的侵染做出反应，过表达可以增强植物的抗病性。因此，本文克隆了MlChi基因的全长gDNA和cDNA，为进一步的功能研究提供了基础。同时通过使用拟南芥同源基因进行蛋白质相互作用网络预测，本文发现这些MlChi蛋白可以分为四类，并且它们与许多防御反应蛋白相互作用。这些结果不仅表明它们参与了Ss应答，而且还揭示了它们可能通过与其他防御蛋白的相互作用而参与了桑树对Ss的应答。
本文还尝试了Ss诱导的桑树几丁质酶基因的原核表达，但是均以包涵体形式存在。由于几丁质酶蛋白通常是亲水的小分子量的稳定形式，因此它们的包涵体可能不是由物理特性引起的。但是，它们比常规蛋白质具有更多的半胱氨酸残基，这意味着它们的正确折叠可能更加复杂。在常见的原核表达条件下，富含半胱氨酸的蛋白质可能易于错误折叠，然后形成包涵体，需要对其进行系统地进一步研究。
总之，本文发现了桑树中对Ss的应答的转录组特征，并初步筛选了42个可能对Ss侵染起关键作用的候选基因。这些候选基因不仅具有组织特异性表达，而且在抗性和易感桑树种之间对Ss侵染的应答具有差异表达。Ss诱导的几丁质酶基因的克隆和表达分析揭示了它们在调节桑树对Ss侵染的反应中的重要功能。本文的研究提供了深入了解桑树对Ss抗性的分子基础，并且得到的MlChi基因可能是通过生物技术提高农作物对Ss抗性的潜在候选基因。
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