CDE：ADC药物PK研究要点
本文作者：季双敏，王玉珠，杨进波（CDE）
ADC药物PK研究要点
导读
抗体偶联药物( Antibody － Drug Conjugate，ADC)由抗体、连接子和小分子毒素组成，在兼具高度靶向性和高细胞毒性优势的同时，由于其结构的多样性和复杂性，以及循环系统中释放的小分子毒素含量较低等特殊性，给其药代动力学研究带来了诸多挑战......
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在ADC 分子中:
①靶点和抗体的选择是ADC 药物设计的起点，是药物适应症的决定性因素，选择的靶抗原通常应在肿瘤或疾病相关且高水平表达;
②连接子在ADC 的体内循环过程中应足够稳定，ADC 药物进入靶细胞后应能将小分子毒素以高效活性的形式快速释放;
③小分子毒素应对于肿瘤细胞具有高效的杀伤作用。靶点、抗体、连接子等因素均可对ADC药物的有效安全性造成影响，以下将对逐一进行讨论。
在确定了目标适应症后，首先需考虑的是哪些抗原在该类肿瘤细胞表面具有特异性且高水平的表达。理想情况下，选择的抗原应高度均匀地表达在靶细胞表面，且在正常组织或细胞表面不表达或少表达; 抗原应是不分泌型的，分泌型抗原可与体内循环系统中的ADC 药物或裸抗结合，从而导致与肿瘤细胞结合的ADC 药物减少，影响药物的疗效和安全性; ADC 药物与抗原结合以后，需要具有合适的内吞途径并具有一定的内吞速率，在细胞内通过酶降解释放小分子毒素。当前，缺乏疗效和脱靶毒性是ADC 药物面临的主要挑战，其中一个重要原因便是靶抗原的低水平表达和内化速率有限。
目前研究人员正在开发解决抗原低表达和内化速度低的方法，如采用抗肿瘤血管生成抗体或双特异性抗体设计非内化型的ADC 药物:
①采用抗血管生成抗体避免内化过程，但可能会出现脱靶效应而影响正常血管的生成，需要谨慎选择靶抗原和相应抗体;
②使用双特异性抗体靶向一种抗原的两个非重叠表位，以增强抗体与抗原之间的亲和力。
在ＲOSSIN等设计的ADC 药物中，采用缺失Fc 区的双抗体靶向抗原，利用额外的化学激活剂在肿瘤细胞外切割连接子，从而释放出游离小分子药物并渗透到肿瘤细胞中，通过这种方式避免因肿瘤细胞的间质压和上皮屏障等造成的内化不足，从而提高抗肿瘤活性。双特异性抗体也可选择性结合肿瘤细胞上的两个不同抗原，从而降低脱靶毒性。
研究显示，一些ADC 药物可利用连接子的物理和化学特性以及肿瘤微环境释放游离的小分子毒素，从而杀伤相邻的抗原表达阴性的肿瘤细胞，这个过程即为旁观者杀伤效应。一些ADC 药物内化后可被代谢释放出不带电荷、可穿透细胞膜的细胞毒性代谢物，并杀伤临近的抗原表达阴性的癌细胞。旁观者杀伤效应对于抗原表达不均一的肿瘤细胞具有重要意义。
需要注意的是，即使是相同靶点，肿瘤类型不同也会影响ADC 的治疗效果，即，同一ADC 药物在不同适应症患者中可能会呈现出不同PK 特征和有效安全性。如，Besponsa是靶向CD22 的Inotuzumab 与烯二炔毒素Ozogamicin 的抗体偶联药物，2017 年被FDA批准用于成人复发难治B 细胞急性淋巴细胞白血病，但Besponsa在复发难治的非霍奇金淋巴瘤的Ⅲ期临床试验却因疗效不佳终止。
在免疫球蛋白G( IgG) 类抗体中，通常会使用IgG1、IgG2 和IgG4 开发治疗用生物制品( 半衰期约18 ～ 21 d) ，IgG3 由于与FcＲn 的受体结合率较低，导致其清除速度较快( 半衰期约为7 d) 因而较少被应用。
目前很多ADC 药物使用的是IgG1 亚型，IgG1 亚型可以发挥抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用( Antibody Dependent Cellular Cytotoxicity，ADCC) 和补体依赖的细胞毒性作用( Complement Dependent Cytotoxicity，CDC) 进一步提高ADC 活性。但同时也存在一定的弊端，ADC 药物与效应细胞的结合可能会影响其靶向肿瘤细胞、减少药物在靶细胞的聚集、并阻碍药物分子进入靶细胞。同时，还需要考虑选择的抗体分子量大小，当抗体分子量太大时，难以透过毛细管内皮层和细胞外间隙，抗体的分子量太小可能会影响其在体内的半衰期。
总体而言，理想的抗体应具有良好的靶向功能，有效地将小分子药物递送到靶细胞中，同时具有较低的免疫原性，且抗体上需具有合适的连接位点与连接子偶联，抗体与抗原结合后可具有一定的内吞速度和有合适的内吞途径，所选择的抗体可保持裸抗的全部或部分功能。
如，首个获批的单药治疗实体瘤的ADC 药物恩美曲妥珠单抗( Kadcyla，T － DM1) ，是由曲妥珠单抗和小分子微管抑制剂DM1( 美登素衍生物) 偶联而成，其中抗体部分为曲妥珠单抗，保持了其裸抗的ADCC 活性。
抗体的肿瘤穿透能力限制、抗原表达量低和内吞效率的限制等因素均可造成细胞内的小分子毒素药物浓度较低，因此小分子毒素需具有较高的细胞毒性。通常情况下，ADC 药物的小分子毒素的靶点位于细胞内，若ADC 药物无法转运至细胞内将会影响药物的有效性和安全性，且在细胞外或解离后可能会对旁边的正常细胞产生毒性。
另外，需要考虑小分子对ADC 药物整体性质的影响，如可能会影响ADC 药物的内吞效率、ADC 药物的极性以及免疫原性。同时，小分子毒素在水性缓冲溶液中通常需具有适当的溶解度，以便于与抗体偶联，偶联后的小分子毒素应具有一定的稳定性。目前采用的小分子毒素主要有美登素、奥利斯他汀、蒽环类药物和喜树碱类似物等。
连接位点与ADC 药物的均一性相关，也是DAＲ分子设计的重要考量因素之一。抗体上的半胱氨酸( 8 个) 和赖氨酸残基( 80 个) 较易发生化学反应而被修饰，因此常作为与效应分子结合的位点。在早期ADC 的开发研究中，通常选择抗体上的赖氨酸作为结合位点，因每个抗体上的赖氨酸残基可达80 个，导致了很大的异质性。而每个抗体上只有8 个游离的半胱氨酸可通过二硫键与连接子连接，用半胱氨酸作为连接位点有助于降低ADC 的异质性。JUNUTULA等报道了一类新型的THIOMAB － 药物偶联物( TDC) ，用工程化的位点特异性半胱氨酸，具有更明确的DAＲ，异质性更小。
中国食品药品检定研究院2018－ 07 － 20 发布的《抗体偶联药物质量控制和临床前评价专家共识》中，药物主要偶联位点、DAＲ 和药物载药量分布是ADC药物质量控制的重要组成部分。
2 ADC 药物的PK 特征
ADC 药物的吸收、分布、代谢和消除对其PK 和PK / PD 关系的理解至关重要，在药物研发过程中会影响候选分子的选择。由于ADC 药物的结构组成中同时包括大分子抗体和小分子毒素，其ADME 特性表征时可能需要混合的方法。因ADC 药物在临床上多通过静脉给药，在此不讨论其吸收特性。
从分子量大小和空间体积方面讲，ADC 药物结构中的主体主要是抗体，因此表现出诸多与裸抗类似的药代动力学特征，具有抗体药物的主要药代动力学特征及作用机制，如靶点介导的药物清除、FcＲn 受体循环及非特异性蛋白酶降解等。ADC 药物与小分子药物和抗体药物的主要PK 特征比较，见表1。总体而言，ADC 药物通常经过静脉给药，分布与抗体药物类似，同时具有抗体和小分子的代谢和清除途径，在低剂量下呈非线性、高剂量下表现出线性特征。
ADC 药物最重要的特征之一是其多样性。因抗体上所偶联的小分子毒素数量和/或结合位点的不同，导致ADC 是由多种不同分子组成的混合物，而当ADC 进入体内后，小分子毒素通过酶解或化学反应从ADC 药物上逐渐解离下来，进一步增加了ADC 药物在体内的多样性。这种不断变化的多样性是ADC 药物的PK 研究的重要挑战之一。
肿瘤细胞或正常组织可能会释放抗原进入循环系统中，与ADC 药物结合清除ADC 药物并影响其分布。ADC 药物与可溶性抗原结合后形成的复合物可被肝摄取并清除，并在此过程中在肝释放出大量的小分子毒素造成潜在的肝毒性。在啮齿类动物研究结果显示，抗体与单甲基金刚烷胺E( MMAE) 结合会影响其组织分布，与未结合的抗体相比，会增加肝的摄取; 其他研究中也看到了类似的现象，小分子毒素的结合对ADC 药物CMD － 193 在人体正常组织和肿瘤中的分布产生了显著影响: 肿瘤的摄取降低，更多地分布在肝中。
在上述案例中，ADC 药物的抗体分布研究采用的是标记抗体的方法。但同时，了解游离和结合的小分子毒素的组织分布也很重要，有研究者开展了在抗体和小分子毒素上进行双重放射性同位素标记研究，结果显示，小分子毒素MMAE 与抗体在多数组织中分布相似，但在肝中小分子毒素的浓度高于抗体。
抗体主要通过靶点介导和非特异性摄取进入细胞，并通过蛋白水解从体内清除。
与裸抗不同，ADC的代谢存在其独有的特点，可通过两种不同的途径( 解偶联和分解代谢) 释放细胞毒性代谢产物。
①解偶联: 连接子裂解，释放出游离的小分子毒素，并保留抗体骨架;
②分解代谢: ADC 药物中的抗体部分蛋白水解为多肽/氨基酸，同时产生游离小分子毒素，或带有连接子的小分子毒素，或带有氨基酸－连接子的小分子毒素类似物，这些代谢产物仍可具有较高的细胞毒性。
通常两种代谢途径在体内同时发生，以哪种途径为主取决于连接子稳定性、结合位点和总载药量等因素。
对于具有易被酶或化学裂解连接的连接子( 如二硫键) 的ADC 药物，通过解偶联过程释放细胞毒性药物可能是主要的途径。若为非裂解型连接子，体内代谢途径可能以分解代谢释放游离小分子及其结构类似物为主。
例如，采用非裂解型偶联子的恩美曲妥珠单抗( Kadcyla) ，体内代谢会形成带有氨基酸残基和/或链接子的效应分子，其中，血浆中MCC － DM1的浓度Cmax值远高于游离的DM1。
由ADC 药物代谢产生的游离小分子毒素及其结构类似物在体内会继续进行代谢和生物转化( 如通过细胞色素P450 酶代谢) ，理论上也存在与其他小分子治疗药物发生药物相互作用( Drug － Drug Interaction，DDI) 的可能，进而影响ADC 药物分解代谢物或其他合并用药的血药浓度。但鉴于ADC 药物在体内循环系统中释放出的小分子毒素浓度较低，通常产生DDI的风险较低。
ADC 药物的PK 研究主要内容包括ADC 药物的稳定性、血药浓度－时间曲线、分布、代谢及排泄过程等; 若小分子药物是新化合物，建议综合应用体内外研究方法，定性和/或定量检测手段，对小分子药物的系统暴露量、血浆蛋白结合及排泄特征、肿瘤和正常组织的摄取/分布特征等进行详细研究，必要时，应对小分子药物代谢产物进行系统暴露量、代谢产物谱、分布、脱落方式、断裂点等研究。
常用于表征ADC 药物PK 特征的分析物包括结合型抗体( 至少偶联一个小分子毒素的抗体) 、总抗体( 偶联和未偶联小分子毒素的抗体) 、结合型效应分子、游离小分子毒素及其类似物。不同分析物的PK所反映的内容和意义不同，整体上构成ADC 药物在体内代谢的全貌。
体内ADC 药物浓度的降低存在两种清除途径:
①抗体部分通过酶降解等方式解体;
②小分子毒素从抗体上完全解离( 即DAＲ 变为0) 。
而影响总抗体的浓度的途径仅有途径①。所以通常会观察到ADC 药物具有更快的清除率，与总抗体浓度清除速度的差异即为效应分子从ADC 药物上完全解离的速度，侧面反映ADC 药物在血液中稳定性，即对比ADC 给药后总抗体与结合型抗体的清除速度，观察到的差异反映的是效应分子从ADC 药物上完全解离的速度。
偶联药物对抗体代谢的影响可以通过给予裸抗体和ADC 药物测得的总抗体PK 进行比较，从而评价小分子药物连接到抗体后对抗体清除速率的影响。在一些ADC 药物的研究中发现，与小分子毒素结合后，可能会加快抗体的清除速度，DAＲ 高的ADC 药物清除更快。
与其他大分子生物疗法类似，ADC 药物在人体内也可诱导免疫反应产生抗药抗体( Anti － therapeutic Antibody，ATA) 。内在因素( 产品相关的) 和外在因素( 患者相关的) 均可能会影响ATA 的发生率，如，ADC药物的相关变体( 如三级结构变形) 可能会增加免疫原性的风险。体内产生的ATA 会中和ADC 药物，是ADC 药物的一种清除途径，增大了ADC 药物本身和裸抗体的清除率。与单抗一样，在临床试验过程中也需要严格监控和评估ADC 药物的免疫原性。
PK/PD 建模可定量反映药物剂量和药理作用( 响应) 之间的联系，是新药研发中的重要组成部分。全面评估暴露－ 反应( Exposure － Ｒesponse，EＲ) 关系可为患者的给药剂量、用药频率和剂量调整等提供建议。相对于未结合的裸抗，ADC 药物通常具有较窄的治疗指数，因此更加需要完善EＲ 分析用于指导临床研究和实际用药。
ADC 药物研发中的PK/PD 分析有其自身的特点和挑战，如，ADC 药物可能会同时存在多种药理作用机制( 例如靶点特异性毒性和非特异性毒性) ，体内代谢会产生多种活性分析物( 例如ADC、总抗体、游离小分子及其结构类似物) ，不同分析物具有不同的药理/毒性作用，在进行PK/PD 研究时应对分析物进行充分考察。
体内多种活性物质的存在使EＲ 关系的建立更加复杂。所选择的驱动药物作用的关键分析物不同，得到的EＲ 关系建模的结果也可能会存在差异。
如，在T － DM1 的研发和申报中，申请人所建立的EＲ PK/PD 模型中，采用的驱动分析物为NCA 预测的T －DM1 的AUC 和Cmax、总抗体的AUC 以及DM1 的Cmax，建立的EＲ 模型显示暴露量与药物疗效无明显的相关性。FDA 在审评过程中建立的EＲ 模型采用的驱动分析物为模型预测的T － DM1 的AUC 和Cmin，模型结果显示对于低暴露量的受试者可考虑增加用药剂量以提高疗效。
ADC 药物代谢机制和代谢产物研究需要体外研究和体内研究、动物研究和人体研究相结合，共同协作、多管齐下。合理的体外研究和动物研究( 包括在表达目标的细胞系中进行的分解代谢研究以及跨物种的血浆稳定性研究) 有助于阐明ADC 的代谢机制和途径，可用以鉴定ADC 分解代谢产物并建立临床前物种的相关性等，为人体内的临床试验提供参考。
例如，在T － DM1 的研发过程中，在大鼠中进行了两项物质平衡研究，分别探索了大鼠体内ADC 和DM1的代谢途径和回收率，为T － DM1 在人体内的临床研究奠定了基础，同时，研究发现DM1 主要通过CYP3A4 /5 代谢，因此在T － DM1 的说明书中建议不与强CYP3A4 抑制剂合并用药，并在上市后继续完成肝损伤患者中T － DM1 的PK 研究。