骨髓间质干细胞成骨诱导分化实验原理

间质干细胞向成骨细胞的分化是理解骨形成机制的有力工具，它也被用于鉴别骨质疏松症、骨修复和成骨不全等遗传紊乱疾病。

同其他组织器官一样，骨组织也在不断地进行着细胞代谢，称为骨代谢。它可以大致分为骨形成和骨重塑两个阶段，前者在个体生长发育期起主要作用，后者则持续整个生命周期。成骨分化是骨生成的关键步骤，即骨髓间充质干细胞经历骨原细胞（osteoprogenitor cells）、成骨前体细胞（pre-osteoblasts）、成熟的骨细胞（osteoblasts）和终末阶段的骨细胞（osteocytes）的一个复杂的过程，其中涉及到多种类型细胞间和细胞内的信号传递，如信号通路、转录因子、生长因子、MicroRNA 等，形成了一个完整的骨代谢调控负反馈环路。不同阶段的细胞群之间无明显的界限，它们是一个连续发生发展的过程。具体过程如下：

1）多种刺激因子和激素的刺激及其他特定的理化因素作用下，间充质干细胞定向分化为骨原细胞；

2）其后，骨原细胞进一步分化为成骨细胞前体细胞，进入快速增殖期;

3）细胞增殖能力逐渐下降，细胞外基质（Extracellular Matrix，ECM）成熟相关基因（碱性磷酸酶、I型胶原、基质钙蛋白）被进一步激活，成骨细胞在此阶段合成和分泌有机基质，形成类骨质，主要由I型胶原形成，特征物是碱性磷酸酶，是成骨细胞分化成熟的早期标志；

4）成熟的成骨细胞表达ECM钙化相关蛋白，主要是骨钙蛋白和骨桥蛋白，成骨细胞矿化活力显著升高。

与成骨分化的体内过程相对应的，体外诱导成骨分化的鉴定主要是通过检测成骨细胞的生物学标志以及相关的标志基因来进行的。短期的成骨分化可通过碱性磷酸酶来检测，长期的成骨分化则通过检测茜红素染色骨结节来鉴定。具体检测以下三种物质：

1）碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）：碱性磷酸酶经固蓝染色后在显微镜下呈现蓝色，未分化的细胞则无明显颜色。可通过统计各样品中细胞碱性磷酸酶的平均表达强度对其成骨能力进行评估对比。可通过统计各样品中成骨分化细胞的百分比加以对比或统计ALP染色照片的平均灰度（固定各项拍摄参数）进行对比，还可通过溶解蓝色物质后测吸光度。

2）“钙结节”：长时间的成骨诱导会使钙离子以钙盐方式沉淀下来，形成“骨结节”。骨结节可通过茜素红染色（茜素红和钙发生显色反应，产生一种深红色化合物），把外面沉积的钙结节染成深红色，通过着色物面积和深浅来表示成骨分化的强弱。

3）MSC成骨分化后明显的成骨细胞特征性基因，如ALP，Runx（runt related gene II）等。可使用RT-PCR对比不同实验组别的成骨分化差异。

下图是骨髓间充质干细胞的成骨分化诱导图，图中深红色部分为钙结节。