基因敲除技术的名词解释和基本原理
统同源重组法、基于自杀载体的同源重组法、基于温敏型质粒的同源重组法。
图1 同源重组的基本原理
RecA 同源重组系统
RecA是大肠埃希菌中的内源性同源重组机制，组成它的蛋白质包括ＲecA 蛋白和ＲecBCD 等。ＲecA 有两个主要功能，一是能够促进
DNA 分子链之间的交换，二是作为共蛋白酶可以促进阻遏蛋白LexA 的自我水解。蛋白ＲecBCD 就是三种蛋白质ＲecB、ＲecC、ＲecD 的复合体，这三种蛋白质可以解开DNA 双链，在Chi 位点处形成DNA 单链。但ＲecA 系统
重组的概率很低、构建重组载体时需要的同源臂较长、ＲecBCD 蛋白具有核酸外切酶的活性而可以降解线性的DNA 片段给替换载体的构建带来了困难。因此，由于ＲecA 同源重组系统需要依赖于特定的限制性内切酶酶切位点，并且需要的同源臂较长，难以成功获得基因缺失突变株。
Ｒed 重组系统
该系统来源于λ 噬菌体，包括Exo、Beta、Gam3 三种蛋白质，进行基因敲除时将编码这三种蛋白质的基因克隆入载体，利用基因翻译成相应的蛋白质进行基因重组。Exo 蛋白具有λ 核酸外切酶活性，能够从DNA 单链的5'端向3'端降解，最后产生3'突出末端而Beta 蛋白恰能与这个有3'突出末端的DNA 片段结合，介导其互补链的退火且保护这个DNA 分子不被降解，最重要的是Exo 蛋白有重组酶活性可以促使同源重组，Gam 蛋白的作用则是防止导入目的菌株的DNA 分子被核酸外切酶降解，其分子量约为16 000 Da，与核酸外切酶结合能够有效抑制核酸外切酶的活性。该系统目前常用的是两步重组法。
图2 两步Red技术的流程
基于自杀载体的同源重组法
所谓自杀质粒就是指当某一特定质粒进入宿主细胞时，要么整合到宿主染
色体上，要么因为不能复制而被消除掉，这是因为自杀质粒的复制需要一种特殊的蛋白质，如果宿主不能够产生这种蛋白质，除非整合到染色体上，那么就不能继续存在，这就是自杀质粒用来作为基因敲除工具的理论基础。因此，不同的微生物需要选择不同的自杀质粒，在目的菌株中自杀质粒迫于生存的需要，会促使自身与染色体发生整合，利用一定的方法，将含有目的基因同源臂的DNA 片段克隆至自杀载体，这个自杀载体上通常需要两个筛选标记，一个正筛选标记，一个负筛选标记，当含有同源臂的自杀载体导入目的菌株时，在生存压力下，自杀载体会与染色体DNA 发生同源重组，即发生第一轮单交换，而后在负筛选的压力下发生第二轮的单交换，最终将基因敲除。常见的自杀载体有pK18mob、pCVD442、pSVP202、pKSV7、pEX18Tc。
基于温敏型质粒的同源重组法
温敏型质粒是一种含有温度敏感型复制子的质粒，它在高温条件下无法复制，在高于37 ℃时会自动去除。比如常见的用于基因敲除的pKC1139、pKD46、pBV220 就是温敏型质粒，pKD46 含有oriＲ101 温度敏感型复制元。当带有目的菌株同源基因的温敏型质粒进入宿主菌株时，在高温条件下，温敏型质粒迫于生存的压力，就会与宿主染色体上的同源序列发生同源重组。
CＲISPＲ/Cas 系统介导的基因敲除方法
CＲISPＲ是在长期进化过程中形成的一种免疫防御系统，用于抵御外源DNA 的入侵，广泛存在于古细菌和细菌中。根据Cas9 蛋白的不同将CＲISPＲ 系统主要分为三种类型，分别为TypeⅠ、TypeⅡ、TypeⅢ。其中TypeII 是最简单并且常用的基因编辑工具。
图 3 工作原理
图 4 突变和基因克隆