慢性应激性抑郁症动物模型的建立方法与注意事项
【造模机制】
采用长期不可预见性:中等强度的电击,刺夺食水、冷水浸袍,反转昼夜节律等应激刺激,造成孤养动物处于抑郁状态,复制抑郁症模型。
【造模方法】
1、动物及分组
选用 Wistar 成年雄性健康大鼠,体重 180～220g。利用旷场实验进行行为学评分,旷场实验水平运动和垂直运动总得分低于 30 分和高于 120 分的动物予以剔除,选择得分相近的大鼠 30 只,随机分为 3 组。1 组:正常对照组 10 只,不加任何处理，每疮 5 只喂养;1组:慢度轻度不可预见性应激抑郁模型组 10 只,单笼饲养,第8日起,按程序给予应激刺激,每日腹腔注射生理盐水 1.0ml:Ⅲ组:抑郁模型组十舒必利治疗组 10 只,单笼饲养,第 8 日起,按程序给予应激刺激,将舒必利溶于 1. 0ml 生理盐水,按 32.5mg/kg每日腹腔一次性注射。
2、抑郁大鼠模型的建立
按照 Katz 的方法略加改进,将明暗颠倒 24 小时,4℃冰水游泳、停水 24 小时、停食 24 小时、夹尾 1 分钟、30V 电压电击足底 5 秒、水平震荡 5 分钟(160Hz)、40℃环境 5 分钟,共九种刺激随机安排到 27 日内,每日一种,每种刺激出现 3 次,同种刺激不能连续出现,使动物不能预料刺激的发生。对照组不予任何刺激,上述各组处理均 27 天,其间进行行为学实验及糖水消耗试验,在第 28 天,即末次处理 24 小时后,断头处死,对治疗组、模型组和对照组进行各项指标的比较。
3、行为学测定
敞箱实验(open-field test):敞箱装置由不透明材料制成.底面为75cm×75cm 的正文形并被等分为 25 个等边方格,周围有高 40cm 的墙壁。7:30～12:00之间在安静的房间内进行此项实验观察。将大鼠置于中心方格内,观察大鼠在 5 分钟内穿越格数(四爪均进人的方格方可计数,为水平运动得分),后肢直立次数(两前爪腾空或攀附墙壁,为垂直运动得分),彻底清洁敞箱后再进行下 1 只大鼠的观察。每周进行 1 次行为学评分。
4、液体消耗
实验实验前,在隔噪声,安静的房间内,训练动物适应含糖饮水,每笼同是放置 2 个水瓶,第一个 24 小时,两瓶均装有 1%蔗糖水;随后的 24 小时,一个瓶装有1%蔗糖水,一个瓶装纯净水。24 小时的禁食、禁水后,进行动物的基础糖水/纯水消耗实验,同时给予每只大鼠事先定量好的两瓶水:一瓶 1%蔗糖水,一瓶纯水,24 小时后,取走两瓶并称重,计算动物的总液体消耗,糖水消耗,纯水消耗,糖水偏爱(糖水偏爱一糖水消耗/总液体消耗×100％)。每 9 天进行 1 次液体消耗实验。
5、体重及摄食量测定
每日 8 ：00 时加食物 50g,饮日 8：00 时称食物余量,同时称动物体重,计算 24 小时摄食量[摄食量=(食物总量-食物余量)/体重×100％]。模型组及治疗组大鼠在接受禁食、禁水刺激时除外。
有磁共振成像技术条件的还可进行下列实验观察：
1、碳共振成像及信息处理
实验在 Bruker B D SPEC 47/50 磁共振仪上完成。动物用 2%代巴比妥钠(40mg/kg)腹腔麻醉,头部在特定支架上固定后进行 T2 加权像扫捕,质于共振频率 200MHiz,重复时间(TR)加权像扫描,质子共振频率 200MHz,重复时间(TR)—225ms,回波时间(TE)=19.4ms,扫描片厚 1mm,相邻两片中心距离 1mim,共扫攝 16片,暴积(N)A)=3次,每次 6个园波。然后选择相同部位的磁共振图片进行大脑纵裂梁度、体积的测量。
2、磁共振
动物用2%皮巴比妥钠腹腔注射麻醉,首次剂量 40mg/kg,以后每小时经腹腔插管追加 8mg/kg 以维持连续麻醉。利用 Burker B D SPEC 47/30 磁共振仪分别测定前脑区域(4.5mm×4.5mm×4.5mm),下丘脑区域(3.5mm×3.5mm×3.5mm)的'H谱,质子共振频率 200MHz,重复时间(TR)=1500ms,回波时间(TE)=136ms,累积(NOA)=6144 次。测量 N-乙酰门冬氨酸(NAA)、含胆碱化合物(Cho),磷酸肌酸(PCt,化学位移3.5)峰高度,计算 NAA/Cho,NAA/PCr和 NAA/(Cho+PCr)的比值。
【模型特点】
大鼠抑郁模型在 27 天建立成功。抑郁组大鼠敞箱实验得分,液体消耗实验中糖水消耗和糖水偏爱百分比均明显下降。抑郁大鼠大脑纵裂加深、扩大;前脑和下丘脑区域磁共振'H 谱 NAA 峰降低,提示本抑郁症模型大鼠有脑萎缩,前脑和下丘脑区域神经元数目减少。
【应用范围】
适用于抑郁症的发病机制、临床诊断和抗抑郁药物的药理作用研究;建立抑郁症脑波谱学研究,研究正常与病理组织之间细胞代谢的区别。这不仅有利于疾病的诊断和治疗,同时对阐明疾病的生理病理过程也有十分重要的作用。该模型已广泛用于针灸治疗和抗抑郁症新中药的研究。
【注意事项】
1、应选择强度适中、综合的应激刺激造模应激因子的多变性和不可预见性是模型成功的关键。制作模型方案中没有一种应激因子单独应用即可产生理想效应,也没有一种应激因子是抑郁模型成功必不可少的。
2、应选择复合性造模方法造模该模型综合了应激与孤养两种经典的制模方法,造模效果较理想。目前制作抑郁症动物模型有多种方法,但都只能表现抑郁症某一方面的症状，因此,同时联合应用几种模型可能会提高实验结果的可信性。
3、应注意造模中新的先进技术和方法的应用该模型采用磁共振成像和波谱新技术，为研究活体脑整体和局部生物化学变化提供了条件。近年来随着医学各学科的发展,一些新的先进技术和方法(如分子生物学,神经影像学等研究技术)正被应用于抑郁症模型的制作中。
【模型评估】
该模型采用慢性轻度应激和孤养两种经典的模型相结合的方式,利用长期不可预见性的轻度应激,造成孤养动物的抑郁状态。该模型所致的行为学改变可持续较长的时间,可为研究抑郁症的发病机制和抗抑郁症药物的药理作用提供较为理想的抑郁症动物模型。特别是该模型应用磁共振仪观察了大鼠脑内整体形态及前脑、下丘脑区H谱的变化,为进一步探讨抑郁症的发病机制,也为寻找抑郁症的新疗法提供实验依据。