抑制过度活化的TGF-β可以减少异位骨化的进展 | 文献精读
背景
异位骨化（HO）是骨外组织中骨的异位形成。HO大部分是获得性，罕见的是先天性。获得性HO是创伤后常见的临床并发症，包括骨折，全髋关节置换术，深度烧伤和中枢神经系统损伤，并导致高患病率。获得性HO的病理机制未知。因此，临床治疗仅限于放疗和/或手术切除已形成的HO，这与非常高的复发率（放疗82-100％，临床17-58％）和非常多并发症。
HO还可见于罕见的遗传性疾病，进行性骨化性纤维发育不良（FOP）和进行性骨发育异常（POH）。在经典FOP患者（98％）中，FOP已被鉴定为骨形态发生蛋白（BMP）I型受体，激活素受体样激酶2（ALK2）中的杂合R206H突变。POH是由GNAS杂合突变引起的膜内骨形成过程。
组织学上，HO和FOP是通过软骨内骨化发生的过程发展起来的，包括四个阶段：炎症，软骨形成，成骨和成熟。多种细胞参与HO，包括组织间充质，血管，循环，造血和骨髓来源的细胞。在FOP鼠标模型中，在内皮细胞中组成型活化的ALK2引起内皮细胞间质转化（EndMT）和获得干细胞样表型。在软骨形成阶段，间充质干细胞/祖细胞（MSPCs）分化为软骨细胞。在FOP小鼠模型中进行的谱系追踪研究进一步证实了Scx +肌腱衍生的祖细胞和肌肉存在的间质Mx1 +细胞在软骨形成阶段产生HO病变中的软骨细胞。在里面成骨阶段，软骨细胞发生肥大和钙化，其次是血管侵入异位骨形成。在最后的成熟阶段，充分发展骨髓形成松质骨。研究TRAP+ 的前破骨细胞分泌的PDGF-BB募集内皮祖细胞和MSPCs以将CD31 high，Emcn high的血管（H型血管）和成骨细胞相关。
人类HO患者的TGF-β活性升高。我们检查了获得性HO的手术标本，在肘关节骨折内固定术后或中枢神经系统损伤在成骨阶段（初始损伤后3-4个月）和成熟阶段（初次受伤后14-16个月)。
H＆E和Safranin O以及HO标本的快速绿色（SOFG）染色揭示了在成骨阶段，松质骨和骨髓附近的厚软骨层。在成熟阶段，观察到较大的发育良好的松质骨和具有较薄的富含蛋白多糖的软骨层的骨髓。
TRAP +前破骨细胞和破骨细胞在成骨阶段显着较高，在成熟阶段降低。
磷酸化的Smad2 / 3阳性（pSmad2 / 3 +）细胞（一种TGF-β下游信号转导物）的数量显着在成骨阶段升高并在成熟阶段降低。
免疫染色证实HO的成骨阶段PDGF-BB +细胞的数量显着增加，并且在成熟阶段降低。
成骨阶段HO患者血清中活性TGF-β1和PDGF-BB的水平明显高于成熟阶段，两者均高于健康对照。通过ELISA定量分析HO成熟早期和晚期成熟期HO患者血清中i活性TGF-β和j PDGF-BB。 虚线表示活性TGF-β为1.23ng / ml且PDGF-BB为1.68ng / ml的健康人的平均浓度。
人类间充质干细胞（MSC）标志物CD73和CD90的免疫染色显示HO骨髓中MSC的数量在成骨阶段显着增加，在成熟阶段减少。
总之，我们的研究结果表明，人类获得性HO通过软骨内骨化进行，HO微环境中具有高水平的活性TGF-β，PDGF-BB和MSC。
活性TGF-β水平升高与HO小鼠血管生成增加有关
小鼠HO模型中HO进展中的骨重建活性，为了检测HO成骨的机制，我们利用经皮穿刺诱导的HO小鼠模型——跟腱穿刺（ Achilles tendon puncture ，ATP），异位骨形成于小鼠模型穿刺后区域继续增加至15周。
H＆E，SOFG染色和II型胶原免疫染色（COLII）显示ATP后典型的软骨内骨化，在穿刺后3周观察到丰富的蛋白多糖和COLII，并逐渐从HO中心移动到邻近软组织的新形成的骨的外层，未成熟的编织骨在6周时出现，并且在9至15周时注意到具有骨髓的充分发育的松质骨。
类似于人类HO，TRAP染色显示穿刺后6周异位骨中TRAP +细胞数量增加，持续的破骨细胞性骨吸收产生大的骨髓腔15周，少量TRAP +细胞可以被观察到。
在第三周时候pSmad2 / 3 +细胞的数量就增加了，并在15周之前保持高浓度。
在HO期间PDGF-BB +细胞的数量也很高从ATP后3周开始进展，在6周时维持，然后在15周时减少。
血清中活性TGF-β1和PDGF-BB的浓度从术后3周开始升高，在9周达到高峰，然后恢复到基线水平。
Nestin+ cells是MSPCs在成人骨髓中的亚群，也在增殖内皮祖细胞中表达。据报道，骨髓中的Nestin +血管与骨钙化有关。Nestin的免疫染色显示与假对照相比，ATP诱导的HO小鼠的HO骨髓中Nestin+细胞的数目显着更高。
CD31和Emcn的免疫染色显示成骨细胞CD31 high Emcn high（H型）血管在ATP后3周围绕跟腱形成的软骨，而Emcn + CD31-血管位于外层，但不在软骨中。在ATP诱导后6周，H型血管被鉴定为在ATP引起的HO中显着升高。小鼠相对于对照组指示成骨阶段为H型血管形成特异性地与新骨形成相耦合。
在骨刺形成后6周，骨钙蛋白阳性（Ocn +）成骨细胞存在，并在15周时减少
ATP诱导的HO小鼠模型表现出与人HO样品中观察到的相似的机制，意味着高浓度的活性TGF-β可能有助于HO的发病机制。
在炎症阶段升高的TGF-β触发HO
炎症是HO开发的初始阶段。巨噬细胞产生TGF-β以启动HO。在HO诱导后4天，高水平的活性TGF-β与增加的巨噬细胞相关。我们发现CD68 +免疫细胞的积累和高水平的活性TGF-β在ATP诱导HO后4天，表明活性TGF-β和免疫细胞与HO的发作密切相关。据报道，炎症刺激可以增强活性TGF-β的释放巨噬细胞。
为了阐述巨噬细胞在HO发生中的作用，我们首先分析集落刺激因子-1（CSF-1）缺陷小鼠（Csf1 - / - ）小鼠，此类小鼠巨噬细胞缺失，因为CSF-1对单核巨噬细胞谱系细胞的存活是必不可少的。HO在ATP造模6周后被抑制。
LysM-cre ::Tgfb1 flox / flox小鼠模型（Tgfb1-/-），其中免疫细胞，包括巨噬细胞/单核细胞谱系和嗜中性粒细胞不再产生TGF-β1。HO造模6周后没有形成HO，而在Tgfb1 flox / flox对照小鼠中HO形成明显。因此它是在炎症阶段由免疫细胞分泌的升高的TGF-β触发HO。
为了进一步验证活性TGF-β升高在HO中的作用，我们研究了具有CED衍生的TGFB1突变（H222D）的TGF-β转基因小鼠，其中高活性TGF-β浓度的表达由I型胶原（COLI）启动（称为CED小鼠）
HO在4个月大的跟腱中自发形成，其中col1大量存在CED小鼠（22只小鼠中的18只），而在野生型（WT）中未观察到异位骨。也在爪子韧带中检测到，这可能是因为跟腱和爪的韧带具有丰富的COLI表达以及更高的活性TGF-β水平，并且主要用于承受更多容易受压或损伤的机械负荷。
在CED小鼠的HO骨髓中相对于它们的WT动物观察到Nestin +细胞要高
CED小鼠中HO的成骨CD31 high Emcn high H型血管数量明显高于其WT小鼠
CED小鼠的HO骨髓中的Ocn +成骨细胞数目显着高于WT同窝小鼠。CED小鼠有一个HO在跟腱中的表型与ATP小鼠模型相似，表明高水平的活性TGF-β是HO发病机制的驱动力。
TGF-β抗体减弱ATP诱导的HO的进展
全身注射TGF-β中和抗体减少异位骨形成和H型血管形成。
接下来我们检查了抑制TGF-β活性是否会减弱HO的进展。将缺乏TGF-β结合能力的相同IgG复合物（13C4）和的TGF-β中和抗体（1D11）一周三次注射入ATP诱导的HO。
（炎症阶段= d1）（软骨形成阶段= w3）（成骨阶段= w6）（成熟阶段= w12）
ATP后15周处死小鼠。相对于对照抗体处理的小鼠，在d1，w3和w6组中注射1D11抗体可显着减轻HO形成，然而，手术后w12注射1D11抗体并不能显着降低HO的形成
为了评估HO进展的信号传导途径的变化。第1天（D1），第3周（W3）和第6周（W6）注射1D11小鼠的HO骨髓pSmad2 / 3 +细胞显着减少。
关于血清中活性TGF-β浓度获得了类似的结果
HO注射1D11后，HO骨髓Nestin +细胞，H型血管和Ocn +成骨细胞的数量也显着减少。
我们将3个月大的CED小鼠腹腔注射1D11或媒介物4周。通过显微CT分析跟腱显示注射TGF-β中和抗体不会形成HO。
这些结果表明在炎症，软骨形成或骨发生阶段抑制TGF-β信号传导活性减弱了HO进展。
TGF-β抗体减弱BMP诱导的HO的进展
将BMP-2 /明胶支架植入腿筋肌肉中以产生HO（BMP-2 /明胶植入模型，BGI）植入2周后形成异位骨并于4周扩大。
H＆E和SOFG染色显示植入后2周形成钙化软骨，4周时骨髓充分发育成骨髓。在第2周时异位骨中TRAP +细胞，pSmad2 / 3 +细胞和Ocn +成骨细胞的数目增加，在术后4周时降至假手术小鼠的水平。这表明TGF-β活性也在通过升高的BMP信号传导诱导HO后出现。
然后我们检查了TGF-β是否在BGI小鼠的HO进展中起直接作用。从植入后第1天（D1），第2周（W2）或第4周（W4）开始，BGI诱导的HO小鼠注射1D11抗体2周，并在8周时杀死。
HO骨形成也显着下降，当W2后注射1D11时，发现W4后相对于对照抗体处理的小鼠，通过μCT分析和H＆E没有显着的HO骨量减少。pSmad2 / 3 +细胞的数量非常少在所有组的HO。与注射1D11抗体的ATP HO小鼠类似，相对于对照，从D1或W2处理的1D11组中Nestin +细胞的数量显着减少。此外，H型血管的形成和Ocn +成骨细胞的数量显着在注射1D11的小鼠中相对于对照抗体注射的小鼠减少，表明骨形成减少。
步幅长度和前足迹/后足迹重叠。结果表明，在用载体或1D11处理HO诱导后，在相对于对照没有显着性的情况下，在步骤交替中步幅交叉和均匀性相似。
在受损部位的Nestin+细胞主要是MSPC，Nestin+ MSPCs参与HO形成的血管生成
由TGF-β增加的异位骨形成的细胞，我们在HO进展过程中分析了Nestin+细胞在转基因Nestin-GFP小鼠模型中使用BGI诱导的HO。在BGI后4周，分离HO病灶中CD45-GFP +Nestin细胞通过流式细胞术。在85％的HO骨髓Nestin-GFP +细胞中检测到小鼠骨髓MSPCs的公认标志物瘦素受体（LepR）的共表达。大约80％的GFP + LepR +细胞也表达Sca-1或CD105，MSPCs的细胞表面标记，而只有2％的GFP + LepR +细胞表达CD31
相比之下，90％的GFP + LepR-细胞为CD31阳性，Sca-1和CD105阴性。
茜素红染色所示和血管生成所示，GFP +细胞能够成骨成血管，表明HO骨髓中的Nestin +细胞参与骨生成和血管生成。
我们接下来通过ATP诱导HO 3周和6周后，在HO进展期间产生taamoifen诱导的Nestin-creERT2 :: R26R-EYFP小鼠以追踪Nestin +细胞。在ATP三周后，超过90％的软骨细胞来源于Nestion+细胞谱系。CD31 / YFP和Emcn / YFP的免疫染色显示在HO发育过程中ATP后6周Nestin谱系细胞形成约70-86％的H型血管。
我们还产生了TGF-βII型受体（Tgfbr2） - 诱导性敲除小鼠（Nestin-creERT2 :: Tgfbr2 flox / flox）。当Nestin-creERT2 :: Tgfbr2 flox / flox小鼠接受ATP或BGI时，小鼠每周三次注射他莫昔芬，特异性地删除Nestin+细胞中的Tgfbr2（Tgfbr2 - / - ）。有趣的是，在ATP或BGI模型的Tgfbr2 - / - 小鼠中没有观察到HO，而在Nestin-creERT2 :: Tgfbr2 flox / flox载体注射的对照小鼠（Tgfbr2 flox / flox）中HO明显（图7a-f）。我们还使用他莫昔芬治疗的Nestin-creERT2小鼠（Cre）作为对照，以排除他莫昔芬作为混杂因素并发现异位ATP或BGI后Cre小鼠中的骨形成。他莫昔芬治疗的Cre小鼠和小鼠之间没有显着差异。
此外，ATP或BGI Tgfbr2 - / - 小鼠与相应Tgfbr2 flox / flox HO小鼠的HO骨髓相比，Nestin +细胞未见于跟腱或极少见于腘绳肌中。同样，在Tgfbr2 - / - 小鼠中跟腱或腘绳肌的H型血管显着减少。这些数据进一步证明活性TGF-β增加Nestin+细胞的血管生成并驱动异位骨形成，抑制其减少HO进展。
总结：
获得性异位骨化（HO）是一种令人痛苦的疾病，其特征在于损伤后骨外骨形成。 HO的确切发病机制仍然未知。显示TGF-β在小鼠中启动并促进HO。我们HO形成后发现钙化软骨和新形成的破骨细胞，导致在HO的微环境中间充质基质/祖细胞（MSPC）募集了高水平的活性TGF-β。TGF-β在肌腱中的转基因表达诱导自发性HO，而系统性注射TGF-β中和抗体减弱创伤和BMP诱导的小鼠HO模型中的异位骨形成，以及在发育异常骨骼进行性小鼠模型中的异位骨形成。此外，诱导型敲除MSPCs中的TGF-βII型受体抑制HO小鼠模型中的HO进展。我们的研究表明升高水平的活性TGF-β作为诱导剂和异位骨形成的促进剂，TGF-β可能是HO的治疗靶点。
参考文献：
1 Wang X, Li F, Xie L et al. Inhibition of overactive TGF-beta attenuates progression of heterotopic ossification in mice. Nat Commun 2018; 9:551.
各位读者：