荧光定量pcr实验常见问题梳理

一、无Ct值或Ct值延迟出现:扩增曲线信号不佳，曲线不平滑:标准曲线线性差。

1.扩增产物大小不合适：实时荧光定量PCR扩增片段的长度通常在80-150 bp之间，如果调整反应的时间有可能扩增500bp的片段。

2.PCR反应过程中退火及延伸的时间过短或过长：应根据扩增片段的大小予与调整。

3.MgCl,浓度不合适：按0. 5mm的间距调整MgCI2的浓度。

4.循环数设置不足：最少设置35个循环，可以增加到45个循环。超过45个循环以上背景信号会增加，对实验结果的分析造成干扰。

5.在错误的PCR反应步骤采集信号：应检查程序设置确保信号的采集是在退火的步骤进行的。

6.加样的误差及错误：注意每次加样的一致性及移液器的校正。

7.DNA模板的起始浓度过低，不能被检测出来：如果模板的浓度未知，最初的实验可以采用较高浓度的模板并进行梯度稀释。最高的模板浓度不超过500ng基因组DNA。

8.模板DNA的降解：使用琼脂糖凝胶电泳检测DNA模板是否降解，检查DNA模板的储存条件是否合适，如果确认降解应重新制备新鲜的DNA模板。

9.梯度稀释标准样品的方法不规范:应注意梯度稀释样品的操作规范，准确。

10.引物或探针设计有误，存在二级结构：通过琼脂糖凝胶电泳检测荧光定量PCR反应结果，是否有PCR产物存在。如果没有PCR扩增产品，应使用引物设计软件检查引物的各种指标是否合适: Tm. 与模板的批配度、 二级结构、扩增片段的长度、非特异型扩增的情况。具体的数据请翻阅前面的相关原理说明

11.引物之间的Tm值相差过多：上下游引物的Tm值差不应超过4C。

12.引物或探针的使用浓度不合适：应将浓度控制在50- 900 nM之间，探针的浓度低于引物的浓度。

13.引物或探针降解：使用琼脂糖凝胶电泳检测DNA模板是否降解，检查DNA模板的储存条件是否合适，如果确认降解应重新制备新鲜的DNA模板。

14.探针设计的位置在扩增片段的5’端：应将探针设计的位置靠近扩增片段的3”端

15.探针被氧化：避免用酸性溶液溶解探针，否则会产生高背景荧光信号及低的扩增信号。推荐的缓冲液是pH8.0的TE缓冲液中。

二、阴性对照有扩增信号(不含有模板)

1.反应环境中残留有之前实验的DNA或PCR产物：实验前清洁实验区及实验仪器避免DNA分子的残留。必要时可以使用UDG酶的方法去除残留的DNA分子

2.阴性对照体系一般会在35个循环后检测到明显的荧光信号，如果过早出 现荧光信号说明有引物二聚体存在。通过融解曲线的分析.在50-60°C度出现峰值。电泳检测无明显的DNA产物出现。

三、融解曲线存在非单一峰

1.存在非特异性扩增：检查各种组分的浓度是否在正常的范围。引物及探针的设计是否合理。前文关于引物及探针一栏有详细的说明。