鱼价暴涨！有效“国际渔药”严重缺乏，诺卡氏菌、链球菌致生鱼、罗非鱼大量暴毙，怎么办？
华中农业大学 陈昌福、武汉科研时代生物技术有限公司 周鑫军、浙江省舟山市海洋与渔业局 油九菊 夏枫峰
摘要：本研究采用含量为93.0%的金霉素（chlortetracycline）原料药与含量为13.0%~15.0%的金霉素预混剂，分别测定了金霉素对危害海、淡水养殖鱼类的鰤诺卡氏菌（Nocardia seriolae）、柱状黄杆菌（Flavobacterium cloumnare）、嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）、温和气单胞菌（Aeromonas sobria）、鳗弧菌（Vibrio anguillarum）和迟缓爱德华菌（Edwardsiella tarda）等6种致病菌的抑、杀菌效果。结果显示出金霉素对这些致病菌株均具有良好的抑、杀菌效果。金霉素原料药对N.seriolae、F.cloumnare、A.hydrophila、A.sobria、V.anguillarum和E.tarda的MIC分别为0.39~1.56mg/L，而MBC分别为6.25~25.0mg/L。
关键词：金霉素；养殖鱼类；致病菌；最小抑菌浓度；最小杀菌浓度
金霉素（chlortetracycline）是用金色链霉菌（Streptomyces aureofacieus）通过发酵而产生，属于四环素类（tetracyclines）的一种抗生素。在我国市售的商品化金霉素产品，主要有金霉素、盐酸金霉素（Chlortetracycline Hydrochloride），盐酸叉向金霉素（Epichlortetracycline hydrochloride）和盐酸去甲金霉素（Demeclocycline）等。
已经有研究结果证实，金霉素的抗菌谱与四环素大致相同，对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、化脓性链球菌（Streptococcus spp.）、肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）、布鲁氏菌（Brucella spp.）、类鼻疽伯克氏菌（Burkholderia pseudomallei）、霍乱弧菌（Vibrio cholerae）、立克次体（Rickettsia）、支原体属（Mycoplasma）、衣原体属（Chlamydia）、非典型分枝杆菌属（Mycobacterium）、螺旋体（Spirochete）以及一些革兰氏阳性和阴性细菌均有比较好的抑、杀灭效果[1]。其抑、杀灭细菌的作用机制，是因为能特异性与细菌核糖体30S亚基的A位点结合，抑制肽链的增长和影响细菌蛋白质的合成。
金霉素作为控制养殖动物传染性疾病的抗生素类兽药，在养殖畜、禽等动物细菌性疾病的防控中，已经有了较长时间的应用，显示出了比较好的药用效果。但是，金霉素对于水产养殖动物致病菌的抑、杀灭效果，尚未见有系统的研究报道。
本研究采用含量为93.0%金霉素原料药，以及含量为13.0%~15.0%的金霉素预混剂，对养殖鱼类的常见部分致病菌完成了在离体条件下的抑、杀灭试验，旨在探讨将金霉素开发为水产用兽药的可能性。现将部分试验结果报告如下。
1
材料与方法
1.1供试药物及药液制备
本研究采用市售含量为93.0%的金霉素原料药和含量为13.0%~15.0%的预混剂。前者采用蒸馏水将金霉素制备成10000.0mg/L浓度后作为供试液体，后者采用盐酸（HCl，36.0%）作为金霉素的溶媒，按照盐酸终浓度为1.0%、2.0%、3.0%、4.0%和5.0%，添加在金霉素预混剂溶液中，将其中的金霉素溶解后，再用蒸馏水将药液稀释至10000.0mg/L的浓度，作为供试药物原液，备用。
1.2致病菌的培养及其菌液制备
将引起海、淡水鱼类鱼类细菌性诺卡氏菌病的鰤诺卡氏菌（Nocardia seriolae），引起淡水鱼类细菌性烂鳃病的柱状黄杆菌（Flavobacterium cloumnare），引起淡水鱼类细菌性败血症的菌嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）和温和气单胞菌（Aeromonas sobria），引起海、淡水鱼类溃疡病的鳗弧菌（Vibrio anguillarum）以及能引起海、淡水养殖鱼类爱德华氏病的迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）等6种致病菌，采用脑心浸液琼脂（BHIA，Difco）培养基进行培养细菌。在接种在平板中的致病菌株，置于28℃的恒温培养箱中培养72h后，采用灭菌生理盐水分别洗下菌落，配置成107cfu/mL菌液浓度，置于4℃冰箱中备用。
1.3最小抑菌浓度（MIC）测定
参照日本化学疗法学会制定的标准法进行[2]。在无菌条件下，取定量的药液，在盛有灭菌脑心浸液（BHI，Difco）培养基试管中，做2倍系列的稀释。制作成药物浓度分别为100.0mg/L、50.0mg/L、25.0mg/L、12.5mg/L、6.25mg/L、3.13mg/L、1.56mg/L、0.78mg/L、0.39mg/L、0.20mg/L和0.10mg/L的药物系列培养基试管。最后，定量吸取0.1mL浓度约为1.2×106cfu/mL活菌液加入上述每支试管中，摇匀。置于28℃条件下恒温培养72 h，经肉眼观察证实无细菌生长试管中的最低药物浓度，即为药物的最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）。
1.4最小杀菌效果
在无菌条件下，从每个未出现抑菌效果的试管中，取0.1mL的培养基，均匀涂布在盛有BHIA培养基的平皿中，将涂布菌液后的平皿置于在28℃恒温培养箱中培养72h后，根据培养皿中出现菌落与否判断药物的杀菌效果，没有出现菌落的试管中最小药物浓度，即为药物的最小杀菌浓度（minimum bactericidal concentration，MBC）。
2
结果
2.1盐酸添加量对金霉素预混剂抑菌效果的影响
将作为溶媒的盐酸在金霉素预混剂溶液中添加终浓度达到1.0%、2.0%、3.0%、4.0%和5.0%的剂量，完成对金霉素预混剂的预溶后，检测金霉素预混剂溶液对A.hydrophila的MIC结果见图1。从图1所示结果可以看出，不同浓度盐酸的添加量，对金霉素预混剂的抑菌效果没有产生明显的影响，其MIC均为6.25mg/L。
1.0%
2.0%
3.0%
4.0%
5.0%
图1，盐酸添加浓度对金霉素预混剂抑制A.hydrophila效果的影响
金霉素预混剂溶液对A.hydrophila等海、淡水养殖鱼类6种致病菌的MIC如表1所示。由表1所示结果可见，在添加盐酸的终浓度在1.0%、2.0%、3.0%、4.0%和5.0%的范围内，金霉素预混剂溶液对海、淡水养殖鱼类6种致病菌的MIC有所不同，对E.tarda的MIC为12.5mg/L，对N.seriolae的MIC为1.56mg/L，而对其余4种致病菌的MIC均为6.25mg/L。作为溶媒的盐酸在金霉素预混剂溶液中添加量，对于金霉素预混剂溶液对6种养殖鱼类致病菌的MIC没有产生明显的影响。
表1,盐酸的添加量与金霉素预混剂溶液对养殖鱼类常见致病菌的最下抑菌浓度（MIC）
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项目 |
盐酸添加量（%）与MIC（mg/L） |
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盐酸（36.0%） |
1.0 |
2.0 |
3.0 |
4.0 |
5.0 |
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A.hydrophila |
6.25 |
6.25 |
6.25 |
6.25 |
6.25 |
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A.sobria |
6.25 |
6.25 |
6.25 |
6.25 |
6.25 |
|
V.anguillarum |
6.25 |
6.25 |
6.25 |
6.25 |
6.25 |
|
F.cloumnare |
6.25 |
6.25 |
6.25 |
6.25 |
6.25 |
|
E.tarda |
12.5 |
12.5 |
12.5 |
12.5 |
12.5 |
|
N.seriolae |
1.56 |
1.56 |
1.56 |
1.56 |
1.56 |
2.2 MIC
金霉素含量为93.0%的原料药与添加1.0%盐酸的含量为13.0%~15.0%的预混剂，对海、淡水养殖鱼类的6种常见致病菌的MIC检测结果如表2所示。由表2可以看出，金霉素原料药对A.hydrophila、A.sobria、V.anguillarum和F.cloumnare的MIC均为0.78mg/L，对E.tarda的MIC为1.56mg/L，对N.seriolae的MIC为0.39mg/L。而金霉素预混剂对A.hydrophila、A.sobria、V.anguillarum和F.cloumnare的MIC均为6.25mg/L，对E.tarda的MIC为12.5mg/L，对N.seriolae的MIC为1.56mg/L。
表2,不同种类的金霉素对淡水养殖鱼类常见致病菌的最小抑菌浓度（MIC）
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药物 类型 |
致病菌名称与MIC（mg/L） |
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A.hydrophila |
A.sobria |
V.anguillarum |
F.cloumnare |
E.tarda |
N.seriolae |
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原料药 |
0.78 |
0.78 |
0.78 |
0.78 |
1.56 |
0.39 |
|
预混剂 |
6.25 |
6.25 |
6.25 |
6.25 |
12.5 |
1.56 |
2.3 MBC
金霉素含量为93.0%的原料药与含量为13.0%~15.0%的预混剂对海、淡水养殖鱼类的6种常见致病菌的MBC检测结果如表3所示。由表3可以看出，93.0%的金霉素原料药对E.tarda的MBC为25.0mg/L，对N.seriolae的MBC为6.25mg/L，对A.hydrophila、A.sobria、V.anguillarum和F.cloumnare等4种致病菌的MBC均为12.5mg/L。含量为13.0%~15.0%的金霉素预混剂对A.hydrophila和E.tarda的MBC为100.0mg/L，对N.seriolae的MBC为12.5mg/L，对F.cloumnare的MBC为25.0mg/L，而对A.sobria和V.anguillarum等2种致病菌的MBC均为50.0mg/L。
表3，不同种类的金霉素对淡水养殖鱼类常见致病菌的最小杀菌浓度（MBC）
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药物 类型 |
致病菌名称与MBC（mg/L） |
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A.hydrophila |
A.sobria |
V.anguillarum |
F.cloumnare |
E.tarda |
N.seriolae |
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原料药 |
12.5 |
12.5 |
12.5 |
12.5 |
25.0 |
6.25 |
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预混剂 |
100.0 |
50.0 |
50.0 |
25.0 |
100.0 |
12.5 |
3
讨论
目前，在我国允许使用的水产用抗生素类药物中的所谓“国标渔药”，只有磺胺嘧啶（sulfadiazine）、磺胺甲噁唑（sulfamethoxazole）、磺胺间甲氧嘧啶钠（sulfadimethoxine sodium）、噁喹酸（oxolinic acid）、氟甲喹（flumequine）、盐酸多西环素（doxycycline）、甲砜霉素（thiamphenicol）、氟苯尼考（florfenicol）以及恩诺沙星（enrofloxacin）等为数不多的几种。除磺胺类药物之外，现有“国标渔药”中的抗生素类产品，其抗菌机理主要是针对革兰氏阴性细菌的。而由于水产养殖动物致病菌已经对各种磺胺类药物产生了比较强的耐药性，将其用于治疗水产养殖动物细菌性疾病的良好效果，已经难以期待。因此，对于水产养殖动物中发生的由革兰氏阳性致病菌引起的疾病，如由无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）对罗非鱼（Oreochromis spp.）等养殖鱼类造成严重危害的链球菌病（streptococcicosis），由鰤诺卡氏菌（Nocardia seriolae）对乌鳢（Channa argus）等养殖鱼类造成严重危害的诺卡氏菌病（nocardiosis），至今尚缺乏能有效治疗的适宜而具有针对性的抗生素类药物。
在水产养殖现场不难见到的现实状况是，当水产养殖动物某种细菌性疾病发生后，水产养殖业者为了减少或避免因病害造成更多的经济损失，采用各种抗生素类药物进行细菌性疾病的治疗，几乎是必然的措施。如果因为选用的药物不合适的话，就不能对细菌性疾病的致病菌显示出良好的药物疗效，水产养殖业者也只能采取反复多次以及继续加大用药量的办法，这也似乎是他们能采取的唯一措施。长此以往，一定会导致致病菌产生更为强大的耐药性。
本试验结果证明，金霉素对于属于N.seriolae的革兰氏阳性菌，显示出了对A.hydrophila等几种革兰氏阴性致病菌更好的抑、杀菌效果。因此，如果将金霉素开发成水产用抗生素类药物，也许是对于弥补我国“国标渔药”中缺乏治疗由革兰氏阳性菌引起疾病药物之不足的缺陷，应该是值得我国水产用药物制售企业家们关注的一个问题吧。
参考文献
[1]中华人民共和国国家标准中华人民共和国国家标准.畜禽肉中土霉素、四环素、金霉素残留量测定方法.GB/T14931.1-94.（高效液相色谱法）
[2]日本化学疗法学会.最小发育阻止浓度の测定方法[J].化学疗法，1975，23（8）：1~2.