ISME Commun: 华中农业大学在菌群收敛机制方面取得新进展
ISME Commun: 华中农业大学在菌群收敛机制方面取得新进展
涌现性基因表达适应性促进合成菌群收敛演化
Emergent transcriptional adaption facilitates convergent succession within a synthetic community
Brief Communication，2021-9-1
ISME Communications, [IF: NA]
DOI：https://doi.org/10.1038/s43705-021-00049-5
原文链接：https://www.nature.com/articles/s43705-021-00049-5
第一作者：Chun-Hui Gao (高春辉)
通讯作者：Peng Cai (蔡鹏)
合作作者：Hui Cao (曹慧); Feng Ju (鞠峰); Ke-Qing Xiao (肖克青); Yichao Wu (吴一超); Qiaoyun Huang (黄巧云)
主要单位：
华中农业大学资源与环境学院，农业微生物学国家重点实验室，国家环境保护土壤健康诊断与绿色修复重点实验室(State Key Laboratory of Agricultural Microbiology, State Environmental Protection Key Laboratory of Soil Health and Green Remediation, College of Resources and Environment, Huazhong Agricultural University, Wuhan, China)
西湖大学工学院，浙江省海岸环境和资源重点实验室(Key Laboratory of Coastal Environment and Resources of Zhejiang Province, School of Engineering, Westlake University, Hangzhou, Zhejiang, China)
英国利兹大学地球与环境学院(School of Earth and Environment, University of Leeds, Leeds, UK)
摘要
Abstract
收敛的现象在菌群的演替过程中十分常见，但是其潜在的分子机制尚不十分明确。因此，在本研究中我们对一个生长在相对封闭环境下的、由两个物种组成的、收敛的合成群落进行了时间序列上的转录组分析。通过分析群落中所含物种的基因表达和群落结构的变化过程，我们发现基因表达差异主要出现在收敛的前期，而群落结构的差异则主要出现在收敛的后期。基因表达变化甚至在合成菌群构建伊始就已经十分显著——我们称之为“零时效应”——这预示着菌群中存在的种间相互作用对物种基因表达的影响是必然的。此外，互作对基因表达的影响还有一个“群体数量效应”，即群落中种群数量较大的物种对较少物种的基因表达的影响较后者对前者更加明显。而且，GSEA分析发现在菌群收敛的过程中有 63 个独特的代谢通路在两个物种中呈现较为显著的变化（约占全部代谢通路的一半左右），其中40个通路是持续抑制的，16个是条件性表达的，只有7个是持续激活的。总的来说，收敛过程中物种的基因表达同时受时间和菌群初始结构的影响。这个研究的结果提示我们：在群落演替的过程中，群落内部固有的种间相互作用可以通过调控物种基因表达促成菌群结构变化，是群落演替的内在驱动力。
前言
Introduction
收敛是演化中常见的现象，对微生物群落的演替过程有重要作用。对于自然界中的微生物群落而言，如肠道菌群、土壤菌群、沉积物菌群、根际菌群、叶围菌群等，收敛通常指的是不同的群落趋于形成相似的物种组成，在这一过程中伴随着物种的丢失和获得。虽然这样的一个收敛现象可以在简单的合成菌群、甚至是单一物种群体中重现，但是由于相关的实验通常是在无菌条件下进行的，因此只会涉及到物种的丢失。特别地，如果一个合成菌群包括了能够稳定共存的多个物种，那么收敛将主要体现在物种的相对比例在不同菌群中逐渐趋于一致。尽管如此，合成菌群为我们研究群落收敛的生态学机制提供了极大的方便。前人已经借助这一策略揭示了细菌群落的收敛可被pH、死亡率以及可用的养分等因素调控。不过，这些研究通常只关注菌群中群落结构的变化，而忽视了对群落中各个物种之间具有的相互作用及其引起的基因表达变化可能具有的重要作用。
结果
Result
在这个研究中，我们使用两株模式微生物，大肠杆菌K-12和恶臭假单胞菌KT2440组成了一个合成菌群体系，并借助它们重现了菌群收敛的过程（编者注：体系由单独培养和2个物种的共培养组成）。在单独培养时，大肠杆菌和恶臭假单胞菌的生长曲线与细菌标准的S型生长曲线完全吻合，可被分为4 h前的对数期和4 h后的稳定期（图1a）。当同样数量的细菌与另一个物种共培养时，它们在群落中的生长曲线基本与单独培养时类似，特别是在对数期基本一致（图1b-d）。与之相比，共培养中“少数派”（编者注：少数派在共培养中的初始数量只有单独培养时数量的0.1%）的数量则能够持续的上升（图1b-d）。另外，统计分析显示3个共培养体系中恶臭假单胞菌的种群数量都高于单独培养时能够达到的值，而大肠杆菌的数量则不高于单独培养时所能够达到的值（图1b-d）。这说明，恶臭假单胞菌对于大肠杆菌的生长有抑制作用，而大肠杆菌对于恶臭假单胞菌的生长具有促进作用。
共培养体系中两个物种的比例最初分别是10^5:10^8 (1:1000), 10^8:10^8 (1:1) 和 10^8:10^5 (1000:1)，经过24 h的共培养后，该数值收敛为约 10^9:10^10（图1e）。特别地，1:1000和1:1的共培养体系中的比值无统计差异（图1f）。群落结构的剧烈变化自4 h时始，而在 0-4 h时则无显著差异（图1e）。也就是说，这个简单的合成菌群收敛的主要特征是两个物种的共存，以及物种间的相对比例逐渐趋于一致。
图 1 a-d，大肠杆菌和恶臭假单胞菌在单独培养（a）和1:1000（b），1:1（c）和1000:1（d）的共培养时的生长曲线。为显示共培养与单独培养时的差异，b-d图中的背景同样显示单独培养时的生长曲线，且标识统计差异。e-f，大肠杆菌/恶臭假单胞菌的比值在24 h时收敛。g-h，大肠杆菌（g）和恶臭假单胞菌（h）在单独培养和共培养时基因表达的动态变化情况。
在转录水平上同样观察到了收敛的现象。PCoA结果显示，不同培养条件下大肠杆菌中的基因表达都随时间沿着坐标系中的特定路径移动，首先从右下方到上方，然后在到左下方（图1g）。大肠杆菌基因表达的变异度最高的情形存在于1:1000的共培养体系中，在0 h和4 h最为显著。类似的，不同培养条件下恶臭假单胞菌的基因表达随时间同样沿着坐标系中的特定路径移动，首先从左上方到下方，然后再到右上方（图1h）。变异度最高的情形存在于1000:1的共培养体系中（0, 4, 8 h）。总体上，基因表达的差异在早期更大，而随着培养时间延长逐渐趋于一致。最终，在24 h的时候达成了基因表达的收敛。因此，共培养体系中能够鉴定出来的差异表达基因在早期会更多一些（图2，编者注：原文中图S2）。
图 2 三个共培养体系中生长的大肠杆菌（a）和恶臭假单胞菌（b）相较于单独生长时的差异表达基因的数量。
总的来说，共培养条件下生长的“多数派”物种对“少数派”物种的基因表达较后者对前者的影响更大。例如，在 1:1000 的共培养体系中，大肠杆菌是“少数派”，它的差异表达基因数目会更多；在1000:1的共培养体系中，恶臭假单胞菌也是如此（图2）。另外，大肠杆菌的基因表达更容易受恶臭假单胞菌的影响，它的差异表达基因总数是恶臭假单胞菌中差异表达基因总数的4倍（图2）。
另外，共培养条件下的基因表达在转型期受到的影响最大。在1:1000的共培养体系中，8 h时大肠杆菌杆菌中多达139个基因上调表达，274个基因下调表达。在1000:1的共培养体系中，8 h时恶臭假单胞菌中则有12个基因上调表达，73个基因下调表达。此外，差异表达基因的数量因培养时间而异。例如，在1000:1的共培养体系中，在0/4/8/24 h时分别有57/69/306/19个差异表达基因。尽管一部分差异表达基因可在不同时间的样本共同存在，但是时间特异性的差异表达基因是占主导地位的（图3，原文图S3）。这些结果说明，在菌群收敛的过程中，物种体内的基因表达在持续性地进行调整。
图 3 Venn 图显示共培养体系中大肠杆菌（a-c）和恶臭假单胞菌（d-f）的差异表达基因分布情况
我们使用 GSEA 方法分析基因表达中那些微小但是确实存在的差异，结果在大肠杆菌和恶臭假单胞菌中分别发现了50和38条代谢通路受到了显著影响。这些代谢通路分别占大肠杆菌和恶臭假单胞菌全部代谢通路的61%和46%。也就是说，几乎有一半的代谢通路在收敛过程中会发生变化。
图 4 GSEA 分析群落收敛过程中大肠杆菌（a）和恶臭假单胞菌（b）受影响的代谢通路。x-轴是取样时间和3个共培养体系，y-轴是KEGG代谢途径。图中点的颜色表示通路被上调（红色）或下调（青色），点的大小表示变化程度的大小。y-轴上的代谢通路按照所含基因的Jaccard相似性排序。c-e Venn图展示GSEA所得代谢通路之间的从属关系。c，物种特有或共有的代谢通路；d，激活或抑制的代谢通路；e，不同物种被激活或抑制的代谢通路。
大肠杆菌中发现的50个代谢通路可以被分为5组（图4a）。第一组含18个代谢通路（自上而下，下同），它们在0-8 h期间基本被抑制，而在24 h时仅仅有少数几个激活。与之相比，第二组中的4个代谢通路在所有的共培养体系中只会被激活。第三组包括17个代谢通路，它们在不同的共培养体系下机会性的表达。第四组包括7个代谢通路，在所有的共培养体系中都被抑制。不过，这些被抑制的通路主要出现在1000:1的共培养体系中，与第一组那些被抑制的代谢通路主要出现在1:1000的共培养体系中形成了鲜明的对比。第五组只包括4个代谢通路，它们在1:1000的培养体系下被激活，而在其他共培养体系中则机会性表达。
恶臭假单胞菌中发现的38个代谢通路可被分为2组（图4b）。第一组包括29个代谢通路，它们在1:1和1000:1的共培养体系下会被抑制，但是在1:1000的体系下却基本不发生显著变化（个别通路例外）。第二组包括9个代谢通路，它们大多被激活表达（除1:1和1000:1共培养体系中有两个途径被抑制）。
在两个物种中一共得到了63个不重复的代谢通路，其中25个是它们共有的，另外25个和13个则分别为大肠杆菌和恶臭假单胞菌特有（图4c）。另外，40个代谢通路在共培养条件下仅被抑制，占绝大多数，而仅有7个代谢通路会被激活，另外16个则条件性的被抑制或被激活（图4d）。这些结果表明与单独培养条件下相比，共培养体系中的物种中多数代谢途径都是被抑制的。但是，被抑制的代谢通路因物种不同而异。例如，在大肠杆菌、恶臭假单胞菌中分别有18个、10个物种特有的代谢通路被抑制（图4e）。另外，在大肠杆菌、恶臭假单胞菌中又分别有4个、2个通路被特异性激活。这些结果进一步表明了，两个物种的代谢变化是特异性的。尽管如此，大肠杆菌、恶臭假单胞菌中共享了12个被抑制的通路和1个被激活的通路（图4e）。其中的五个通路，即氨酰-tRNA 生物合成、ABC 转运蛋白、核糖体、苯丙氨酸代谢和不同环境中的微生物代谢等，在大肠杆菌和恶臭假单胞菌中均被有条件地抑制/激活（图4e）。
讨论
Discussion
两个物种组成的共培养体系是研究群体数量变化和种间相互作用的一个经典且理想的系统。例如，通过分析两种草履虫种群数量的变化，科学家提出了生态学上著名的“竞争排除原则”（编者注：也称高斯定理，在生态学里指的是：两个物种不能同时或长时间地在同一个生态位生存）。尽管本研究只采用了两株模式微生物，但是相应的结论理论上可以推广到类似条件下的微生物群落中去的。但是，需要注意的是，这种推广是有前置条件的：首先，这两个物种可以稳定的共存；其次，两个物种的组成在培养一段时间后能够收敛。这样一来，我们就可以得到以下三条收敛菌群基因表达的典型特征。
第一，“零时效应”，指的是群落中基因表达的变化自初期就已经开始显现。大肠杆菌、恶臭假单胞菌都是具有广泛适应性的物种，在各种各样的生境条件下都有发现。因此，我们最初预计在共培养的初期，它们能够从培养基中获取充分的营养，并且有比较充裕的生长空间，所以基因表达受到的影响可能是最小的。但是事实恰恰与之相反，实验结果发现在初期受影响的程度反倒比较大，而且自0 h时就开始显现了。此外，我们还发现尽管在共培养体系中生长的物种与单独培养条件下生长的物种具有相同的群体数量，其内在的基因表达变化仍然是十分显著的。这些结果说明共培养条件下，种间相互作用对基因表达的影响几乎是必然的，与养分的供给和种群的密度无关。
第二，“群体数量效应”，指的是多物种共存时，“多数派”对“少数派”基因表达的影响程度更大。共培养24 h后，恶臭假单胞菌可占全部种群的90%以上，因此它是绝对的“多数派”。相应的，总体上，恶臭假单胞菌的基因表达受到的影响相对较小。但是，在1000:1的共培养体系中，当初期恶臭假单胞菌的群体数量暂时处于劣势时，其基因表达受到的影响相对大肠杆菌仍然会比较显著。
第三，“严谨调控效应”，指的是菌群中基因表达同时受到时间和初始群落结构的精准调控。与单独培养时相比，共培养条件下生长的物种会抑制比较多的代谢途径。这些被抑制的通路与碳代谢、脂肪酸代谢、次级代谢产物的生物合成等有关。 相比之下，激活的途径是有限的，与氨基酸的生物合成、RNA 降解、细菌分泌系统等有关。有迹象显示，通过这些变化细胞代谢被引导到基因翻译和分泌上去了。
综上所述，我们分析了合成菌群整个收敛过程中的基因表达变化，并进一步总结出了该过程中转录调控三个典型特征。由于群落结构的变化晚于基因表达的变化，并且我们的实验设置基于封闭的肉汤培养系统，因此可以得出结论，基因表达的变化诱导了群落的收敛。而这些模式的提出提供了对细菌群落融合的分子基础的进一步了解。
参考文献
Gao, C.-H.; Cao, H.; Ju, F.; Xiao, K.-Q.; Cai, P.; Wu, Y.; Huang, Q. Emergent Transcriptional Adaption Facilitates Convergent Succession within a Synthetic Community. ISME COMMUN. 2021, 1 (1), 1–5. https://doi.org/10.1038/s43705-021-00049-5.
第一作者简介
第一作者：高春辉，华中农业大学资源与环境学院青年教师，主要关注微生物种间相互作用机制，主要依托合成菌群的研究体系，优化了种间相互作用模型，发现了菌群初始结构调控的涌现性特征，揭示了菌群收敛过程中基因表达调控的核心特征等。近三年来以第一作者或通讯作者在 ISME J、ISME Commun、Frontiers in Genetics、Microb Ecology等杂志上发表研究论文6篇。
通讯作者简介
通讯作者：蔡鹏，教授、博士生导师、华中农业大学资源与环境学院副院长、中国土壤学会青年工作委员会副主任、国家优秀青年科学基金与英国皇家学会“牛顿高级学者”基金获得者，主要从事土壤生物膜界面过程、微生物互作与生物污染控制等方面的研究。迄今以第一作者和通讯作者在在ISME J、npj Biofilms & Microbiomes、Environ Sci Technol、Geochim Cosmochim Acta、Soil Biol Biochem、Appl Environ Microbiol等土壤和环境科学主流期刊发表论文50余篇，H因子37。担任Soil Ecology Letters、Engineering、Journal of Soil and Sediments、《农业资源与环境学报》等期刊编委。