编译：夕夕，编辑：夏甘草、江舜尧。

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导读

气孔谱系细胞发育的调控已被广泛研究。然而，基于单细胞转录组研究这一生物学过程还尚未报道。本文，作者主要对拟南芥5日龄的12844个单细胞进行了RNA测序。作者鉴定到了11个簇，对这些细胞簇中最高可变表达的基因进行比较分析，发现转录网络可以调控分生组织母细胞向保护母细胞发展。通过伪时间分析检查marker基因的发育动力学揭示了它们之间的潜在相互作用。作者的研究为了解鉴定新的marker基因如何参与气孔谱系细胞发育调控提供了重要信息。

论文ID

原名：Global Dynamic Molecular Profiles of Stomatal Lineage Cell Development by Single-Cell RNA Sequencing

译名：利用单细胞RNA测序研究气孔谱系细胞发育的分子动态

期刊：Molecular plant

IF:7.15

发表时间：2020.6

通讯作者：孙旭武

通讯作者单位: 河南大学生命科学学院作物胁迫适应与改进国家重点实验室

DOI号：10.1016/j.molp.2020.06.010

实验设计

结果

1.气孔细胞系的基因表达模式

为了系统的解析在不同发育阶段的特定气孔谱系细胞中的基因表达模式，作者通过酶消化五日龄拟南芥幼苗的子叶来制备原生质体。从整个组织分离的原生质体中用marker基因鉴定特殊细胞类型已成功用于研究几组根细胞的概况。用40μm孔细胞过滤器筛选原生质体，以获得超过20,000个单个细胞。随后进行10X Genomics建库测序。共获得13999个单细胞转录组信息，过滤后共获得12844个单细胞，可进行下一步分析。使用t-SNE分析，将12844个单细胞共分为11个簇（图1A），每个簇中的细胞占总细胞数的2.2%-22.4%（图1B）。需要注意的是，每种细胞类型的百分比仅代表本研究中获得的细胞，并不能反映子叶中实际细胞的比例。为了验证不同降维技术是否会产生相似的细胞簇，作者使用UMAP算法来进行可视化。使用UMAP算法鉴定到了相似的细胞簇。此外，进行了Pearson相关分析，结果表明，通过tSNE和UMAP识别的细胞簇高度相关。这些结果表明，不同的降维技术会产生相似的细胞簇。由于某些marker基因在不同的发育阶段表达量不同，因此作者使用多个marker基因来鉴定代表气孔发育不同阶段的细胞类型。对于叶肉细胞（MPC），作者使用RBCS和LHCB作为MPC的marker基因，对于表皮细胞，作者选择HDG2,POLAR,SPCH,TMM,MUTE和EPF2作为marer基因，MUTE，BASL，SPCH和EPF2作为早期分生组织（EM）细胞的marker基因，BASL，MUTE和EPF1作为晚期间充质（LM）细胞的marker基因，而EPF1，HIC，FAMA和SCRM作为GMC的marker基因，RBCS，FAMA和SCRM的高表达结合TMM的低表达被用作GC的marker基因，RBCS，FAMA和EPF1作为YGC的marker基因，IQD5和RBCS作为PC的marker基因。由于GC和YGC中存在叶绿体，因此作者也使用RBCS作为这些细胞的marker基因，图1C和D显示了不同气孔细胞类型中所选marker基因的表达模式。

图1 标记基因鉴定细胞类型

2.marker基因在气孔谱系细胞中的表达

为了进一步验证作者确定的细胞类型，作者分析了几种已知的调控气孔谱系细胞发育的marker基因的表达。结果显示，FAMA，TMM，HIC和SCRM在YGC和GMC中特异性表达，而其他marker基因的表达在特定细胞类型中不特异性表达。为了探索气孔谱系细胞的潜在调控因子，作者分析了不同簇中的基因表达谱，并鉴定了每个单个细胞簇中的高表达marker基因（图2A和B）。这些marker基因中的某些可能与调节气孔谱系细胞的发育有关，例如SLAC1和SCAP1。与PME6在保卫细胞中高度表达并且是气孔功能所必需的研究一致，的结果表明PME6在YGC和GMC中高度表达（图2A）。为了验证marker基因的表达模式，作者在研究中将其表达谱与先前报道的结果进行了比较，与之前的一项研究一致，一些marker基因在气孔谱系细胞中显示较高的表达，例如，ATML1和TMM在GMC和MMC中高表达。然而，根据作者的研究，一些新发现的marker基因的表达与之前的研究的表达模式不同。例如，LM标记基因bZIP9在LM和GC中均高表达，而MMC标记基因AT1G29670在YGC中也高表达。由于缺乏特殊的标记基因，PC的鉴定相对困难。

图2 鉴定每个簇的新marker基因

3.GO分析富集不同细胞类型的基因

为了研究每种细胞类型中表达的基因的潜在生物学功能，作者对所有细胞簇进行了GO分析。通常，大多数terms的丰度与单个细胞类型有关。但是，与多种细胞类型相关的那些GO term代表了更普遍的生物学过程。为了衡量该方法在鉴定细胞类型表达基因中的可靠性以及将生物学过程正确地归因于细胞类型的能力，作者将一系列富含GC的基因与先前有关GC功能的研究进行了比较。与已发表的研究一致，作者发现基因对氧化应激，盐胁迫，细菌有反应，镉离子以及涉及气孔运动和光合作用的元素在GC和其他气孔谱系细胞中高表达。作者的分析进一步扩大了与GC开发相关的生物学过程的范围，包括蛋白质转运和细胞死亡，GO热图分析表明，MMC，EM，LM和GMC相似。在这些细胞中，表达的基因不参与光合作用。但是，富含EM和GMC的基因与蛋白质转运和囊泡介导的转运有关。

4.气孔谱系细胞早期发育中转录因子（TFs）调控网络的分析

为了发现参与调节气孔谱系细胞早期发育的潜在TF，作者研究了在不同细胞类型中高表达的TF。在u.k._1中，TF的数量最多，而在MPC_5中数量最少（图3A）。有趣的是，作者发现在MMC，EM和GMC中，BPC1，BPC2，BPC4和BPC6和WRKY33的表达明显更高（图3B）。BPC蛋白和WRKY33是重要的TF，参与调节幼苗的生长发育和胁迫反应。为了研究BPC和WRKY33调控气孔谱系细胞早期发育的机制，作者通过分析与MMC，EM，LM和GMC共同表达的基因，分析了它们参与MMC，EM，LM和GMC的调控网络。如图3C所示，ATML1，BPC1，BPC6，SCRM，PIF5和WRKY33可以作为核心TF来调节MMC，EM，LM和GMC中靶基因的表达。为了研究BPC和WRKY33与已知TF之间的相互调节，我们分析了它们的调节网络。如图3D所示，BPC1和BPC6基于共表达正调控大多数已知的TF，表明BPC1和BPC6可通过这些相互作用调控气孔谱系细胞的早期发育。

图3 鉴定不同细胞类型中转录因子（TFs）的调控网络

5.WRKY33和BPC参与调节气孔的早期发育

为了调查已鉴定的TF对气孔谱系细胞发育的影响，作者分析了它们的特征图。如图4A所示，BPC1，BPC2，BPC4和BPC6的表达主要在MMC，EM和GMC中增强，而在所有细胞类型中均可检测到WRKY33的表达（图4A）。对气孔发育模式的分析表明，与野生型相比，wrky33中GC的数量减少，而M和GMC的数量增加（图4B-D），这表明wrky33在调节细胞分化方面也存在缺陷。M到GMC或GMC到GC。已有研究人员证明BPC6参与ABI4的调控，作者的亚细胞定位研究表明BPC6-GFP位于保卫细胞的细胞核中（图5A）。实时定量PCR（qPCR）分析表明，bpc1 bpc2 bpc3 bpc4 bpc6 bpc7 sextuple突变体中SPCH，MUTE，FAMA，SCRM和SCRM2的表达水平低于WT（图5B）。进一步的分析表明，在bpc1 bpc2 bpc4 bpc6四重突变体和bpc1 bpc2 bpc3 bpc4 bpc6 bpc7六倍体突变体中，气孔指数（SI）升高，而与WT相比，BPC6-GFP中的SI降低了（图5C-E）。在EM，LM和GMC中BPC1，BPC2，BPC4和BPC6的表达较高的观察表明，BPC可能介导了从M到GMC的早期气孔发育。

图4 核心TF的特征图和功能分析

图5 BPC蛋白参与调节气孔的发育

6.标记基因表达的发育伪时序分析

为了重建分化过程中的发育轨迹，作者使用Monocle 2从scRNAseq数据中对细胞进行了伪时序分析。总体而言，伪时间路径具有三个分支（图6A和B），并且可以在伪时间路径的不同分支位置上相对清晰地排列不同的细胞簇（图6B）。通常，从MMC到GC可以看到气孔谱系细胞的不同发育过程（图6B），令人惊讶的是，PC集中在一个伪时间分支中，该分支与其他细胞类型显着不同（图6B）。原则上，不同细胞类型在发育轨迹上的分布特征可以初步确定这些细胞在发育阶段之间的关系。GMC和YGC在发育轨迹中的分布相对集中，但是在沿着发育轨迹的几个时间点可以找到MPC_2和MPC_5（图6B），这表明MPC的细胞发育阶段更加复杂。如图6C所示，前5个标记基因的伪时间热图显示，它们的伪时间模式可以分为两个簇。在第一个簇中，所有标记基因的表达随伪时间逐渐增加。在第一个簇中，标记基因主要来自MPC，这表明MPC处于更成熟的发育阶段（图6C）。第二个簇可以分为三个分支：在第一个分支中，主要来自YGC，GC和MPC的标记基因的表达首先逐渐增加到最大水平，然后沿伪时间迅速减少。在第二个分支中，主要来自u.k._1和EM的标记基因的表达在发育开始时很高，但随着伪时间迅速下降。在第三分支中，标记基因的表达主要来自MMC和EM，在整个发育时期沿伪时间都较低，而在伪时间的最后阶段则进一步下降。在发育的早期，标记基因EPF1，SPCH和MUTE的表达高度相似（图7A和B）。尽管SCRM和SCRM2在调控气孔谱系细胞发育中与MUTE和SPCH有一些功能性相互作用，作者的伪时序结果表明SCRM，SCRM2，MUTE和SPCH基因的表达差异显着。有趣的是，我们的结果表明，SPCH在伪时间过程中显示出与ERL1，EPF1和HDG2类似的模式（图7A和B）。

图6 簇和选定marker基因的伪时序分析

图7 已知marker基因的伪时序分析

2 重磅综述 | Cell：非编码RNAs在肿瘤学中的作用（IF=36.216）

科研| Molecular plant：利用单细胞RNA测序研究气孔谱系细胞发育的分子动态

译名：利用单细胞RNA测序研究气孔谱系细胞发育的分子动态

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