科研 | CELL REP: 膳食乳化剂直接影响粘附侵袭性大肠杆菌基因表达以驱动慢性肠道炎症
编译：杨峰，编辑：景行、江舜尧。
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膳食乳化剂羧甲基纤维素（CMC）和聚山梨酯-80（P80）可以扰乱肠道微生物群，促进慢性炎症。微生物群最少的小鼠可以免受乳化剂的影响，这促使研究人员假设这些化合物可能会激发特定的病理生物来促进炎症。用克罗恩病相关的致病菌-粘附侵袭性大肠杆菌（AIEC）定殖Gnotobitic 野生小鼠和IL-10-/-小鼠，随后给予CMC或P80。当食用乳化剂时，GF和改良的Schaedler菌群（ASF）小鼠的AIEC定植会导致慢性肠道炎症和代谢紊乱。在IL-10-/-小鼠中，AIEC单定殖导致严重的肠道炎症反应。在体外将AIEC暴露于乳化剂中可增加其运动性和粘附在肠上皮细胞上的能力。转录组学分析显示乳化剂可以直接诱导一系列基因的表达，这些基因可以介导AIEC的毒性和促进炎症反应。综上所述，乳化剂可以促进病菌的毒力和入侵，这些化合物可以驱动携带这些细菌的宿主产生炎症提供了一种方式。
论文ID
原名：Dietary Emulsifiers Directly Impact Adherent-Invasive E. coli Gene Expression to Drive Chronic Intestinal Inflammation
译名：膳食乳化剂直接影响粘附侵袭性大肠杆菌基因表达以驱动慢性肠道炎症
期刊：Cell Reports
IF：13.256
发表时间：2020年10月
通讯作者：8.109
通讯作者单位：Benoit Chassaing
DOI号：10.1016/j.celrep.2020.108229
实验设计
结果
饮食乳化剂CMC和P80给WT小鼠造成低程度的肠道炎症和代谢综合征。这种乳化剂诱导的表型在GF小鼠和ASF小鼠中均不存在，这导致研究者假设乳化剂可能通过作用于存在于许多宿主中的致病细菌而促进肠道炎症。因此，研究者研究了在ASF小鼠中加入AIEC是否会使它们容易受到CMC和P80的促炎作用。用AIEC参考菌株LF82定植ASF小鼠，如图S1A所示，并测量乳化剂对肠道炎症和代谢的影响。给予CMC或P80的ASF/AIEC小鼠表现出一系列肠道炎症特征，包括结肠重量增加、结肠缩短、结肠重量/长度比增加，以及脾脏重量增加和粪便脂质卡林-2（Lcn2）水平升高的非显著趋势（图1A-1G）。这些炎症指数与促进和/或反映炎症的基因的肠表达增加有关（图1H、1I和S1C-S1F）。
此外，结肠切片的组织学评分表明，与对照组相比，CMC-和P80治疗组小鼠的炎症显著增加（图1J和S1K）。此外，乳化剂诱导的肠道炎症与代谢综合征的特征相关，包括体重、脂肪垫质量和空腹血糖水平升高（图1K-1M）。将炎症的所有形态学和分子测量结合到主坐标分析中，使用Bray-Curtis距离与对照组动物相比，CMC-和P80处理的动物表现出明显的聚集性，进一步突出乳化剂处理小鼠炎症水平的增加（图S1G）。总之，这些数据表明，传统小鼠和ASF小鼠不同，ASF小鼠可完全抵御乳化剂诱导的肠道炎症和代谢失调，ASF小鼠中AIEC定殖的小鼠易受乳化剂诱导的低度炎症及其代谢后果的影响。
图1.AIEC细菌的定植促进乳化剂对正常防护的ASF小鼠的有害影响。6周大的ASF C57BL/6 小鼠定植LF82菌并暴露于CMC 或 P80中12周其(A)结肠重量；(B)结肠长度；(C)结肠重量/长度比；(D)脾脏重量；(E)第0天、(F)第28天和(G)第56天的粪便Lcn2的量；(H)IL-1-β和(I)IL-10的定植的mRNA表达水平变化；(J)结肠组织学评分；(K)最终体重；(L)脂肪垫重和(M)5小时空腹血糖浓度。
2 AIEC定殖导致乳化剂处理后微生物组成的改变
研究者设想乳化剂可能通过促进AIEC丰度的增加和/或微生物群组成和/或活性的更普遍的改变而导致ASF/AIEC小鼠的炎症。为了研究这些可能性，研究者首先通过16S rRNA基因测序检测乳化剂对AIEC/ASF小鼠肠道菌群组成的影响。虽然研究者之前报道过ASF小鼠完全可以抵御乳化剂引起的微生物群组成变化，未加权Unifrac距离的主坐标分析显示，与给水对照的小鼠相比，P80处理的AIEC/ASF小鼠在第56天的微生物群落组成发生了明显的变化（图2A-2C；非参数多元方差分析 P值=0.015）。微生物群落组成的这种变化不是由AIEC相对丰度的变化引起的（图2D；基于16S数据），而是由ASF物种水平的变化引起的，例如，P80处理小鼠的梭菌科（ASF 356和/或ASF 502）完全消失（图S2A）。相比之下，CMC给药并没有导致AIEC/ASF小鼠的微生物群有明显的整体差异，但与细小的变化有关，例如梭状芽孢杆菌科成员的增加（图S2A；ASF 356和/或ASF 502），以及对聚乳酸菌属减少的趋势（图S2B；ASF 519）。这些结果与研究者之前使用体外微生物系统的研究一致，该系统表明P80直接改变微生物群落的组成，而CMC则直接影响微生物群基因的表达。
图2.AIEC细菌对ASF小鼠的定植引起乳化剂介导的微生物群改变。提取粪便DNA，通过16SrRNA基因测序分析微生物组成；(A-C) 第0天(A)、(B)第28天和(C)第56天基于非加权Unifrac距离的主坐标分析；（D）粪便微生物区系肠杆菌科的相对丰度。(E)第0天和(F)第56天的粪肥鞭毛蛋白C基因表达水平；(G)在第0天和(H)第56天粪便LPS水平；(I)在第56天粪便细菌密度和(J)AIECLF82细菌的相对丰度。
接下来，研究者研究了CMC和P80功能对微生物群促进肠道炎症能力的影响程度。细菌鞭毛是宿主与细菌相互作用的一个重要介质，鞭毛蛋白的主要成分鞭毛蛋白通过TLR5和NLRC4直接激活宿主促炎基因的表达。因此，研究者使用TLR5报告细胞并观察到，与在乳化剂存在下粪便鞭毛蛋白没有任何变化的ASF小鼠相比，由AIEC定植的ASF小鼠食用CMC或P80导致鞭毛蛋白水平更高（图2E和2F），而粪便脂多糖水平不受乳化剂用量的影响（图2G和2H）。应用于纯化粪便DNA的定量PCR表明，粪便鞭毛蛋白的增加并非由于粪便细菌密度的改变或粪便AIEC丰度的变化（图2I和2J）。鞭毛增加的一个潜在后果是穿透粘液层的能力增强，导致细菌上皮细胞减少距离（即微生物群入侵），这是IBDs和代谢综合征肠道炎症的一个特征。Carnoy固定结肠标本共聚焦分析测量距离从上皮表面分离肠道细菌显示，食用CMC或P80的ASF/AIEC小鼠的微生物群受到侵犯（图3A-3D）。根据这些结果，研究者测定了肠内粘蛋白2和凝集素样蛋白ZG16（酶原颗粒蛋白16）的表达，这是一种丰富的粘液蛋白，有助于维持细菌的上皮距离，以及含有Ly6/PLAUR结构域的8（Lypd8），后者可防止鞭毛微生物入侵结肠上皮。结果发现，与对照组相比，CMC处理的ASF/AIEC小鼠ZG16和Lypd8的表达均增加（图S1I和S1J），而粘蛋白-2的表达没有变化（图S1H）。这些结果表明，宿主对排斥入侵细菌的反应仍然是有效的，这与乳化剂促进入侵可能反映对微生物群落的影响这一观点一致。为了进一步了解CMC和P80是如何影响微生物群-上皮相互作用的，研究者利用激光捕获显微切割技术，这是研究者最近开发的一种识别内部粘液微生物群的方法。这种方法表明，在ASF/AIEC小鼠中，在乳化剂处理下，由于ASF群落最初缺乏蛋白质细菌（63.2%–82.9%；图3E），因此，在ASF/AIEC小鼠中，显著多数的内部粘液细菌是蛋白质细菌，特别是AIEC菌株LF82。虽然CMC和P80均未显著影响内部粘液的相对微生物群组成（图S2C），但靠近上皮的AIEC的高丰度表明乳化剂对该细菌的影响可能在介导这些化合物对肠道的影响中起关键作用。
图3.AIEC细菌的定殖引起正常防护的ASF小鼠的微生物群入侵。(A)水、(B)CMC-和(C)P80-的微生物区系定位的共聚焦显微镜分析：Muc2（绿色)、肌动蛋白(紫色)、细菌(红色）和DNA(蓝色）；(D)每只小鼠在三个高功率电场中，最接近IEC的细菌的距离；(E)激光捕获内粘液层的显微解剖，收集粘液相关微生物区系；粪便和粘液相关微生物用16SrRNA基因Illumina测序分析其组成；在门级进行的分类总结的表示。
3 AIEC本身就足以使小鼠受到乳化剂的有害影响
为了研究CMC和P80对ASF/AIEC的影响是由AIEC单独介导的，或者是反映AIEC对微生物群落组成的长期影响，研究者用AIEC参考菌株LF82对GF小鼠进行单定植，然后将这些小鼠用乳化剂处理。如图4所示，AIEC本身使小鼠容易受到CMC和P80的促炎作用，这反映在结肠重量、结肠长度和脾脏重量略有增加（图4A-4G）。此外，结肠标本的组织学评分表明，与对照组小鼠相比，CMC-和P80治疗组动物的炎症显著增加（图4H和S2D）。在肥胖症中这些轻度炎症指数与轻度增加相关，虽然未观察到对总体重的影响（图4I和4J）。类似于对ASF小鼠的观察，将所有这些形态学和分子测量值结合到主坐标分析中，使用Bray
-Crutis距离证明，与对照组AIEC单殖动物相比，CMC-和P80处理的动物具有明显的聚集性（图S2E）。
图4.AIEC细菌的单定殖足以在野生小鼠中引起乳化剂的有害影响。(A)结肠重量；(B)结肠长度；(C)结肠重量/长度比；(D)脾脏重量；(E)第0天、(F)第28天和(G)第56天的粪便Lcn2；(H)结肠组织学评分；(I)最终体重；(J)脂肪垫重；(K)第56天AIECLF82细菌的相对丰度；(L)最接近AIEC细菌到IECs的距离在每种条件超过三个高功率场每只小鼠的情况下。
接下来，研究者研究了AIEC LF82细菌对CMC和P80暴露的反应。使用定量PCR定量测定粪便中AIEC水平表明，绝对AIEC丰度不受CMC或P80的影响（图4K）。然而，对Carnoy固定结肠标本进行共焦分析，以测量AIEC LF82细菌与上皮表面的距离，结果显示，在食用CMC或P80的AIEC单定植小鼠中，细菌受到了侵犯（图4L），暗示乳化剂诱导的AIEC基因表达改变促进了一种侵犯表型。而在任何情况下，如观察到的其它物种都有明显的微生物影响，如P80等，则说明这些微生物的影响更为明显。
接下来，研究者检测了AIEC本身是否会使IL-10/乳化剂治疗引起结肠炎的倾向性，后者在常规条件下非常容易发生结肠炎，但在GF条件下不易发生。将GF IL-10-/-小鼠用AIEC参考菌株LF82进行单次定植，然后给予CMC或P80。
大多数（80%）AIEC定殖IL-10-/-小鼠在P80治疗后40天内死亡，出现明显的肠道炎症迹象，包括脾脏重量轻微增加和结肠缩短（图5A-5F）。这种严重的疾病在CMC处理的小鼠中没有发现；相反，这些小鼠表现出轻微炎症的证据，包括结肠重量增加时结肠缩短（图5A-5F），进一步说明了CMC和P80对宿主微生物群关系的不同影响。通过qRT-PCR分析结肠中CXCL-1、IL-1-β和肿瘤坏死因子α（TNF-α）的表达，支持AIEC单相关IL-10-/-小鼠易发生乳化剂诱导的肠道炎症（图5G-5I），而IL-6和IL-22的表达无变化（图S3A和S3B）。通过Bray Crutis距离主坐标分析对这些形态学和分子测量值进行组合评估，结果表明，与对照组AIEC单定殖IL-10小鼠相比，CMC和P80处理的动物有明显的聚集性（图S3C）。根据先前的研究报告，高水平的TNF-α和IL-1β促进恶病质，IL-10-/-小鼠的肠道炎症不会导致代谢综合征（图5J和5K）。
图5.AIEC细菌的单定殖足以在IL-10-/-小鼠中产生乳化剂的有害影响，并促进野生小鼠结肠癌的发生。(A-H)显示的是生存曲线(A)、结肠重量(B)、结肠长度(C)、结肠重量/长度比(D)、脾脏重量(E)、盲肠重量(F)、最终体重(G)和脂肪垫重量(H)；(I-K)Cxcl1(I)、IL-1-β(J)和TNF-α(K)的克定植mRNA表达水平； (L)每只小鼠的肿瘤数目和(M)总表面或肿瘤面积(mm2）。
4 膳食乳化剂通过转录组调节增加AIEC的致病潜力
上述结果表明，了解乳化剂对AIEC的直接影响可以阐明这些化合物有害影响的潜在机制。因此，研究者在体外研究了CMC和P80对AIEC的影响。研究者首先研究了乳化剂暴露对AIEC定义特征的影响，即粘附和侵入IECs的能力。仅在CMC和P80（图S6A和S6B）中观察到对AIEC生长的轻微抑制作用，这与研究者在体内观察到的粪便AIEC密度不受乳化剂暴露影响相一致。然而，研究者观察到CMC和P80都以剂量依赖的方式增加了AIEC对Int-407 IECs的粘附力（图6A），而侵袭能力不受影响（图6B）。接下来，研究者通过RNA测序（RNA-seq）方法广泛研究了CMC和P80对AIEC基因表达的影响。CMC以浓度依赖的方式显著影响AIEC LF82转录组，如图6C火山图所示。CMC还影响染色体和质粒基因表达的表达（图S6C和S6D）。相反，这种方法表明P80对AIEC基因表达的影响不大。利用主坐标分析显示这些转录本证实了CMC诱导了一种强烈的浓度依赖性的改变AIEC转录组，而P80有一个微妙的，尽管是显著的影响（图S7A和S7B）。受乳化剂影响的细菌基因包括毒力因子和参与许多过程的基因，包括脂多糖生物合成、DNA复制和转录（图S7C–S7G）。例如，编码DnaA引发剂结合蛋白的diaA表达由CMC和P80以剂量依赖方式显著诱导（图S7F），表明乳化剂对AIEC复制和适应度有广泛影响。在AIEC细菌分泌的众多毒力因子中，鞭毛（由主要亚单位鞭毛蛋白FliC组成，并受FlhDC主调节器调节）、1型菌毛（由主要亚基FimA组成）和长极性鞭毛（由主要亚基LpfA组成）在细菌的运动、粘附中起着中心作用，和派尔斑的锚定，这些毒力因子的表达被CMC以剂量依赖的方式显著增加（图6D），而P80在调节AIEC毒力基因表达方面的作用似乎很小。此外，编码已知AIEC毒力因子的其他基因受到乳化剂暴露的显著影响，如图S7C热图所示，CMC诱导多种已知AIEC毒力因子的表达，而P80对VI型分泌系统有影响。因此，CMC和P80可以被AIEC细菌直接感知，导致细菌转录组的改变和许多病毒因子的表达增加。
图6.膳食乳化剂通过转录组调节增加AIEC的致病潜力。(A)用不同浓度的CMC和P80与IECs在体外培养的AIECLF82的粘附和(B)侵袭能力；(C)用不同浓度的CMC和P80体外培养AIEC参考菌株LF82，提取mRNA并进行RNA-seq分析；(D)进行qRT-PCR分析，检测FLIC、FLHDC、FIMA和LPFA基因的表达；(E)用不同CMC或P80（1%）体外培养的AIEC参考菌株LF82的活力测定。
5 鞭毛有助于AIEC调解乳化剂诱导炎症
与其对AIEC基因表达的影响一致，CMC显著增加了鞭毛介导的AIEC运动性（图6E），而P80不影响这种表型。鉴于鞭毛/运动在介导AIEC促进炎症和粘液渗透方面的潜在作用，接下来研究者检查了鞭毛蛋白是否是AIEC引起乳化剂诱导炎症的必要因素。GF野生小鼠用AIEC-LF82-ΔfliC等基因突变株单系定植，然后进行乳化剂处理。与鞭毛AIEC单相关的小鼠对CMC的反应仅表现出轻微的肠道炎症反应，与代谢综合征的指标无关，而P80对这些小鼠完全没有影响（图7和S8）。此外，在这些LF82-ΔfliC单定植小鼠中，P80处理组的上皮增殖状态正常化，而CMC和P80治疗组的凋亡活性正常化，表明AIEC鞭毛在乳化剂消耗后改变IEC周转中起关键作用（图S4和S5）。因此，乳化剂增加AIEC促进肠道炎症的能力似乎在一定程度上是由鞭毛介导的。
图7.细菌鞭毛蛋白有助于AIEC介导的乳化剂有害作用。(A)结肠重量；(B)结肠长度；(C)结肠重量/长度比；(D)脾脏重量；(E)第0天、(F)第28天和(G)第56天的粪便Lcn2；(H)结肠组织学评分；(I)最终体重；(J)脂肪垫重；(K)第56天AIEC LF82细菌的相对丰度。
讨论
肠道微生物群在调节饮食成分对健康的影响方面起着关键作用。这一概念的最好理解的例子是肠道细菌将复杂的碳水化合物分解代谢为短链脂肪酸，这有助于能量的收集，并对肠道健康产生各种有益的影响。此外，微生物群组成对多种食物的反应能够广泛预测餐后血糖控制，这突出了特定细菌类群在调节饮食如何影响宿主方面的作用。其中一些关键的媒介物也会对宿主的饮食产生有害影响。与本研究密切相关的一个例子是本文的研究结果，小鼠给两种常见的合成乳化剂CMC和P80后，会发生肠道炎症，从而导致一系列疾病，包括结肠炎、代谢综合征和癌症。乳化剂诱导的炎症是由微生物群介导的，在这个意义上，它与微生物群组成和定位的变化相关，并且乳化剂在GF小鼠中缺乏明显的影响。乳化剂对ASF小鼠也没有影响，因为ASF小鼠的微生物群非常有限，因此表明CMC和P80干扰了肠道和它通常所处的不同微生物生态系统之间复杂的相互关系；然而，这种干扰是如何发生的尚不清楚。本文的的研究结果-乳化剂可以直接诱导致病性大肠杆菌在内部黏液中的致病基因表达和侵袭，这种方式足以使小鼠容易受到这些化合物的有害影响，从而填补了这一知识空白。
与ASF小鼠相比，仅携带AIEC或在其他ASF物种中携带AIEC的小鼠表现出乳化剂诱导的炎症，这一观察结果可得出结论：AIEC的存在足以介导CMC和P80的有害影响。虽然很难就AIEC的存在如何使小鼠易受乳化剂的影响得出确切的结论，但这些化合物在体外直接诱导AIEC毒力基因表达的能力表明了一种可能的机制。具体而言，研究者假设，在体内未被吸收的CMC和P80的摄入导致它们与AIEC直接相互作用，增加促进其穿透粘液层和粘附于上皮细胞的基因表达，从而激活宿主促炎症信号。因此，研究者认为携带AIEC可能是一个特定的决定因素，个体在很大程度上容易在乳化剂消耗后发生炎症。
对沙门氏菌和肠出血性大肠杆菌等经典病原菌的基本致病机理的研究揭示了感知环境的复杂机制，允许在选定的条件下稳健、快速地诱导毒力基因表达。众所周知，AIEC有一些类似的传感机制，这表明乳化剂可能会影响细菌表面，而细菌具有其洗涤剂的性质。具体而言，这表明这些化合物可能改变AIEC的通透性以选择分子，从而改变AIEC周质内稳态，这在AIEC细菌毒力基因表达的调控中起着重要作用。这种机制提供了一个潜在的解释，为什么CMC和P80对AIEC基因表达可能有一些相似但又不同的影响，因为这些化学性质不同的清洁剂可能会以独特的方式影响渗透性。这种机制还可以解释P80看似不寻常的浓度依赖效应，因为低浓度的P80可能会影响AIEC对特定分子的渗透性，而较高浓度的P80也可能增加对其他分子的渗透性，并产生反作用。在任何情况下，P80的类似剂量依赖性先前在体内都能观察到。
CMC对AIEC毒力基因表达的影响比P80更大，它模拟了研究者在模拟人类肠道微生物生态系统（SHIME）模型中对复杂的人类微生物群的研究，其中CMC对微生物基因表达有快速、显著的影响，而与物种组成的差异无关。相反，P80改变了SHIME系统中的微生物群组成，这与本文在AIEC/ASF小鼠中观察到的结果相似，只有P80显著影响了微生物群的组成。虽然CMC和P80的不同作用机制尚不清楚，但它们也可以通过这些化合物对微生物表面的直接影响来解释。有趣的是，乳化剂的类似洗涤剂的特性导致研究者假设这些化合物可能会影响宿主微生物群的相互作用，进而导致肠道炎症。然而，这一假设是基于乳化剂可能影响粘液功能特性的概念。虽然这一可能性仍在考虑之中，但研究者试图得到支持性数据的努力尚未成功。相反，本文迄今的研究结果表明乳化剂对细菌本身的影响足以解释其有害影响。
结论
本研究证明，饮食乳化剂上调AIEC毒力基因表达，促进肠道炎症。此外，这项研究进一步强调了CMC和P80对致病菌的特殊作用，这表明乳化剂在组合使用时会产生协同的有害效应，这在加工食品中经常出现。虽然在复杂的微生物群中确定乳化剂对AIEC影响的重要性仍然是未来研究的一个重要挑战，研究者推测可能存在多种乳化剂反应细菌。因此，研究者认为非吸收的食品添加剂直接作用于选择微生物类群可能被证明是预测食品添加剂有害影响的一个重要考虑因素。此外，这些发现进一步支持了基于微生物群的饮食干预在慢性肠道炎症管理中的必要性，其中携带特定微生物群成员的个体将受益于有针对性的饮食建议。
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