科研│INT J MOL SCI：硼替佐米作用的分子机制：miRNA–mRNA相互作用的新证据
编译：伊安，编辑：景行、江舜尧。
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硼替佐米是一种抑制26S蛋白酶体降解泛素化蛋白的抗肿瘤药物。虽然有研究认为硼替佐米激活凋亡相关的转录调控，但其对非编码RNA介导的转录后基因沉默调控的影响机制尚不完全清楚。在本研究中，研究人员对人神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）经硼替佐米作用后基因和miRNA表达的变化以及miRNA-mRNA相互作用进行分析，以此来研究硼替佐米对SH-SY5Y的作用途径。通过全基因组RNA和miRNA微阵列技术分析硼替佐米作用SH-SY5Y 24h后整体基因和miRNA表达谱，通过qRT-PCR和Western blot组学分析验证结果。在硼替佐米作用SH-SY5Y后，共有719个基因和28个miRNAs下调， 319个基因和61个miRNAs上调。硼替佐米诱导神经毒性有关的异常miRNA/mRNA之间可能存在相互作用，影响神经再生、细胞钙转运和神经元死亡。硼替佐米可能对SH-SY5Y产生毒性作用，并调节miRNA-mRNA相互作用。为了阐明硼替佐米的作用机制，需要进一步研究miRNA-mRNA特异性相互作用。
论文ID
原名：Molecular Mechanisms of Bortezomib Action: Novel Evidence for the miRNA–mRNA Interaction Involvement
译名：硼替佐米作用的分子机制：miRNA–mRNA相互作用参与的新证据
期刊：International Journal of Molecular Sciences
IF：4.556
发表时间：2020年1月
通讯作者：Bogusław Machali´ nski
通讯作者单位：波美拉尼亚医科大学
DOI号：10.3390/ijms21010350
实验设计
结果
1 SH-SY5Y细胞活力
50 nM/L硼替佐米刺激24h显著抑制SH-SY5Y细胞活力（图1），其中，与对照组和25 nM/L剂量相比，阿尔玛蓝的还原百分率更高(活细胞百分比更低)。
图1.阿尔玛蓝检测细胞存活率。硼替佐米作用12或24小时阿尔玛蓝减少的百分比。*与对照细胞比较，P<0.0001。
2 神经细胞基因表达谱
微阵列分析显示，与对照组相比，硼替佐米作用SH-SY5Y后有719个基因至少下调2倍，319个基因至少上调2倍（图2）。对差异表达基因进行GO分类。功能注释分析发现对功能注释的分析确定了16个凋亡过程，这些过程被显着上调（如凋亡信号通路的调节；内在凋亡信号通路；凋亡信号通路或凋亡过程的正调控）和19个神经再生过程被显着下调（如神经调节；神经元的产生;神经元的发展；神经元分化调节；神经元投射发育调节；中枢神经系统神经元分化）（图3）。
图2.硼替佐米作用的SH-SY5Y与对照组相比整体基因表达的散点图。红点表示基因下调（|fold change|≥2；p < 0.05）；绿点表示基因上调（|fold change|≥2；p < 0.05），该图还包含了表达变化最大的基因的名称。
图3.根据GO分类，硼替佐米作用的SH-SY5Y与对照组相比差异表达基因进行涉及凋亡和神经再生的生物学过程气泡图。气泡大小表示相应注释所代表的基因数。上调和下调用颜色表示，绿色表示上调，红色表示下调。考虑到硼替佐米对患者的神经毒性作用，研究人员对与神经系统有关的生物学过程进行研究。通过比较硼替佐米作用SH-SY5Y和对照组的复杂基因数据集，研究人员发现了几个参与神经再生的基因(−28.9≤fold change ≤−2)。所选基因的基因表达差异的具体数值见表1。其主要负责神经组织功能的关键过程，如神经元细胞分化、迁移、再生、保护、轴突引导、突触形成和增殖。
表1.与对照组相比，硼替佐米作用SH-SY5Y后参与神经再生的15个下调差异表达基因。Ca2+稳态的失调也可能导致神经系统紊乱，并引发神经病变症状。研究人员观察到五个下调的基因 (−25.7≤fold change ≤−2），参与了对神经元传导至关重要的钙转运（表2）。此外，硼替佐米作用SH-SY5Y后，上调的14个基因与神经元死亡相关（2≤fold change ≤21.9）（表3）。硼替佐米作用SH-SY5Y后差异表达基因的进一步分析揭示了参与凋亡调控的基因（表4 ,表5）。
表2.与对照组相比，硼替佐米作用SH-SY5Y后参与Ca2+转运的下调差异表达基因。
表3.与对照组相比，硼替佐米作用SH-SY5Y后参与神经元死亡的10个上调差异表达基因。
表4.与对照组相比，硼替佐米作用SH-SY5Y后参与凋亡的10个上调差异表达基因。
表5.与对照组相比，硼替佐米作用SH-SY5Y后参与抗凋亡的下调差异表达基因。研究人员通过qRT-PCR验证差异表达基因(Neurogen2、NFIB、CNTN1、SOD1、DDIT4、CASP7、SOX4、GADD45A、C12orf5、 ASCL1、DDTI3)mRNA表达水平（图4）。同时通过Western blot验证了差异表达蛋白（NEUROGEN2、SOX4、CDK6、Casp7）表达水平（图5）。
图4.与对照组相比，硼替佐米作用SH-SY5Y后差异表达基因Neurogen2、NFIB、CNTN1、SOD1、DDIT4、CASP7、SOX4、GADD45A、C12orf5、 ASCL1、DDTI3 mRNA表达水平(n = 3)。（与对照组相比，* p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001）
图5.与对照组相比，硼替佐米作用SH-SY5Y后差异表达蛋白NEUROGEN2、SOX4、CDK6、Casp7表达水平(n = 3)。（与对照组相比，* p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001）
3 神经细胞miRNA表达谱
由于miRNA调控基因表达，研究人员将miRNA表达芯片的结果与基因组芯片分析获得的数据进行了综合分析。单个miRNAs及其靶基因差异倍数见（表6,表7，表8，表9）。功能注释分析发现，与对照细胞相比，SH-SY5Y经硼替佐米作用后差异表达基因涉及16个凋亡过程(例如，凋亡信号通路、神经元凋亡、凋亡调节、凋亡DNA片段化)和10个与神经再生相关的过程(例如，调节神经再生、神经元投射发育、神经元分化)（图6）。
MiRNA表达分析结果显示，与对照组相比，硼替佐米作用SH-SY5Y后有61个miRNA显著上调(|fold change|≥2)，28个miRNA显著下调(|fold change|≥2)。图7显示了硼替佐米作用SH-SY5Y后miRNAs表达的散点图。接下来，研究人员分析了硼替佐米作用SH-SY5Y后调控神经发生和凋亡相关基因miRNA的表达，发现22个miRNAs上调，这抑制了25个神经再生相关基因的表达(表6)。进一步分析表明，23个显著上调的miRNAs调节30个抗凋亡过程相关基因的表达，并导致硼替佐米作用SH-SY5Y中这些基因的表达下调。所有下调的miRNAs中有2个（|fold change|≥2）可调控参与神经元死亡的基因表达，9个上调的miRNAs（|fold change|≥2）可调节17个参与促凋亡过程的基因表达（表7-9）。
研究人员选择了6个明显异常的miRNAs进行qRT-PCR实验(miR34a-5p、 miR192-5p、 miR21-3p、miR218-5p、miR22-5p、miR335-5p)（图8）。
图6.与对照组相比，硼替佐米作用SH-SY5Y中差异表达miRNA参与的凋亡与神经再生生物过程（p < 0.05）。气泡大小表示参与亡与神经再生miRNA的数量。
图7.与对照组相比，硼替佐米作用SH-SY5Y miRNAs表达散点图。红点表示miRNAs表达下调(|fold change|≥2，p<0.05)，绿点表示miRNAs表达上调(|fold change|≥2，p<0.05)。
表6.与对照组相比，硼替佐米作用SH-SY5Y差异倍数最大的神经再生相关miRNAs列表。
表7.与对照组相比，硼替佐米作用SH-SY5Y差异倍数最大的促凋亡相关miRNAs列表。
表8.与对照组相比，硼替佐米作用SH-SY5Y差异倍数最大的神经元死亡相关miRNAs列表。
表9.与对照组相比，硼替佐米作用SH-SY5Y中差异倍数最大的抗凋亡相关miRNAs列表。
讨论
硼替佐米具有强大的抑制蛋白酶体活性，与抑制抗凋亡蛋白、p53稳定、细胞周期进程破坏等关键细胞过程相关。利用mRNA和miRNA表达分析，研究人员首次证明硼替佐米作用会导致神经细胞中一些与神经再生和凋亡相关的基因和miRNA的失调。
首先，研究人员假设硼替佐米影响神经再生。虽然NEUROG2、ASCL1、SYT4等基因表达下调，但未发现与miRNAs的特异性相关。miR-1303已被证明能促进SH-SY5Y细胞的增殖，其表达上调可能与神经母细胞瘤细胞有关；相关研究表明miR-1303在神经母细胞瘤细胞和组织中表达上调。miR-1303抑制具有神经再生作用的双皮质素(DCX)，它的缺失会导致严重的形态缺陷和沿吻端迁移流的延迟迁移。另一个显著上调的miRNA是miR-21-3p，它抑制NCAM2、ELMO1和GPAM的表达。与本次研究相反，Wang等人的研究表明硼替佐米抑制miRNA-21的表达。在人类骨髓瘤细胞系中miRNA-21抑制导致细胞增殖、迁移、侵袭、血管生成和转移的凋亡和肿瘤抑制基因的表达，并抑制了细胞凋亡。本研究结果显示miR-21失调导致神经元死亡，这是因为miR-21靶向下调miR-21。NCAM2主要表达于大脑，在大脑中刺激神经突生长，促进区分树突和轴突。ELMO1通过减少细胞凋亡保护内皮细胞，这也是在糖尿病情况下肾小球保护和肾细胞存活的重要因素。
研究还发现了在神经元发育和重建过程中靶向基因的miRNA过表达之间的相关性：miR-6824、miR -335、miR -1468都靶向参与神经胶质细胞髓鞘化的SOX4；而miR-6836以TFAP2B为靶标，在小脑GABA能中间神经元中起重要作用。有趣的是，该研究在某种程度上证实了MYC- mir34a轴中miR-34a的凋亡作用受到MYC的严格调控，从而导致耐药性，但miR-4668(也上调并靶向MYC)在这些相互作用中的作用尚不清楚。miR-3192的过表达和相应的CHRNB2的下调(CHRNB2可确保神经元信息传递)可能是另一种可能的神经毒性机制，原因是轴突运输受到抑制。此外，作为miR-21-3p靶点的NCAM(fold change=-5.59)可激活多种信号转导通路或基因，如胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)等。
硼替佐米的细胞毒性也归因于线粒体介导的钙稳态失调。线粒体钙超载是导致线粒体肿胀的一种促凋亡途径，线粒体外膜受到干扰或破裂，随后线粒体凋亡因子释放到胞浆中。胞内钙稳态失调可能是药物诱导神经细胞凋亡的新机制。Landowski等人证明硼替佐米的细胞毒性作用是通过细胞钙库的短暂释放介导的，从而导致caspase-12激活诱导线粒体钙流入和凋亡。
尽管没有发现特异性的miRNA-mRNA相互作用，本研究发现编码钙通道（CACNA2D2，CACNG4）和调节钙水平（ITPR1）的重要基因低表达 (表2)。这些基因的下调可能会对神经功能产生重大影响，因为它们调节细胞内钙的释放，而钙是神经细胞功能的基础，包括神经元兴奋性、神经突生长、神经递质释放、线粒体能量产生和细胞命运变化。这些数据支持硼替佐米可能通过破坏神经细胞内钙稳态诱导神经毒性的假设。
另一种可能性是硼替佐米触发氧化应激，这有助于促凋亡和神经中的基因表达的重编程。在本研究中，研究人员发现参与凋亡的基因显著上调，尤其是与神经元死亡相关的基因。差异倍数最大的基因是聚类蛋白(CLU)、血红素加氧酶 (HMOX1)、caspase 7(凋亡相关半胱氨酸肽酶，CASP7)和DNA损伤诱导转录本3 (DDIT3)，这些基因的产物由细胞应激合成并出现在凋亡细胞中。Larner等人证实CASP7在大鼠创伤性脑损伤(TBI)后的神经元和星形胶质细胞中均显著上调和激活，并可能在患者创伤性脑损伤的细胞死亡中发挥作用。本次研究发现miR-124与白细胞介素6受体（IL6R）的相互作用可能有助于硼替佐米发挥作用，因为IL6R是包括NF-κB、MAPK和JAK/STAT在内的几个重要通路之间的连接因子，这些通路参与了多种细胞反应，包括细胞存活、炎症和分化。本次研究中，miR-218显著上调自噬相关SQSTM1表达，SQSTM1在自噬缺陷的肿瘤细胞中上调，并在自噬结束时下降。在本研究中观察到SQSTM1上调导致自噬增强，可能是通过作用于ERK磷酸化而导致硼替佐米的神经毒性。IGF1R在硼替佐米中的作用也被提出，本次研究表明 miR-4423和miR-551显著影响IGF1R表达。本研究中最显著的下调miRNAs之一是miR6880-5p，它导致促进神经元死亡的促凋亡基因C12orf5的表达下调（表8）。miR6880-5p下调时，C12orf5表达不再下调，该研究观察到C12orf5表达上调。同样，miR-26b-5p的下调可导致DDIT4、HSPD1、ADAM17、DDIT4、HSPD1、EPHA2和RNF216的表达增加。这些基因促进细胞凋亡、DNA损伤和神经元死亡。因此，诱导神经元细胞凋亡可能是硼替佐米的作用途径。
本研究主要关注的是miRNA/mRNA的相互作用，但也有几篇报道描述了基因/miRNA的失调，它们之间没有确切的相互作用，但这也与该研究结果相关。Liu等研究证实硼替佐米治疗大鼠模型DRG中ATF3、c-JUN和CCL2的表达显著上调。siRNA阻断c-Jun/ATF3-CCL2信号通路已被证明可以减轻硼替佐米引起的机械痛。这些结果表明，c-jun和ATF3通过增强c-jun和ATF3之间的相互作用上调CCL2参与了硼替佐米诱导的机械性痛觉超敏。有趣的是，紫杉醇可显著上调大鼠背根神经节神经元ATF3的表达，提示ATF3可能参与了化疗所致的神经毒性。研究人员观察到与对照组相比，硼替佐米作用神经细胞后ATF3 (fold change=6.37)和JUN (fold change = 2.74)的表达上调，但CCL2的表达没有变化。这可能是由于本研究设置的培养时间较短，也可能是由于实验模式不同。
总的来说，该研究得到了一些有趣的结果，但也存在一些不足之处。第一个限制是只能在一个时间点和一个剂量下进行阵列实验；此外，研究人员没有进行功能验证分析来进一步研究mRNA-miRNA相互作用对神经发生、神经元死亡和细胞钙转运的影响。研究人员认为不同的药物剂量、时间点和细胞模型对进一步阐明硼替佐米作用的潜在机制具有重要意义。由于本研究的基础性和初步性，应该谨慎地确定硼替佐米作用对mRNA-miRNA相互作用以及神经毒性的影响。
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