科研|ENVIRON SCI TECHNOL：AgNPs能够改变未种植以及种植黄瓜的土壤微生物和代谢物（国人佳作）
编译：Peragh，编辑：谢衣、江舜尧。
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纳米银是应用最广泛的工程纳米材料之一，但纳米银的意外释放可能导致纳米银颗粒在土壤中积累，最终会对环境构成未知的风险。因此了解纳米银的暴露对土壤微生物群落和植物物种的影响对于纳米银的风险评估和设计可持续的纳米农业平台都是至关重要的。本研究采用100 mg/kg的纳米银对土壤进行为期60天的处理，通过16S rRNA基因序列测定和土壤代谢组学分析方法研究纳米银在黄瓜植株存在和缺失两种情况下对土壤细菌群落结构和代谢物组成的影响。此外还研究了植物在介导纳米银毒性对微生物群落的影响中所起的作用。结果表明，纳米银暴露显着提高了未种植和种植黄瓜土壤的pH值；两种土壤中细菌群落结构在纳米银暴露后都发生了变化，同时与碳、氮和磷循环相关的几个重要的功能细菌群也受到了纳米银的影响；植物在介导纳米银对细菌群落的影响方面作用有限。土壤代谢组学分析表明，纳米银改变了未种植和种植黄瓜土壤的代谢物分布，明显变化的代谢物参与了糖和氨基酸相关的代谢途径，这表明C、N代谢受到扰动，这与细菌群落结构结果一致。此外，在未种植和种植黄瓜的土壤中，暴露于纳米银的土壤中几种脂肪酸都显著减少，这表明生物细胞膜上可能存在氧化应激。这些结果为理解纳米银暴露对植物物种和土壤微生物群落的生物和生化影响提供了有价值的信息。
论文ID
原名：Silver Nanoparticles Alter Soil Microbial Community Compositions and Metabolite Profiles in Unplanted and Cucumber-Planted Soils
译名：AgNPs能够改变未种植和种植黄瓜土壤微生物群落组成和代谢物组成
期刊：Environmental Science & Technology
IF：7.270
发表时间：2020.2
通讯作者：赵丽娟&季荣
通讯作者单位：南京大学环境学院
实验设计
本实验所用土壤采自中国科学院海伦农业试验站，采集土壤上部的20 cm，经风干后过2 mm筛子。同时在AgNP原液制备中，将1000 mg AgNPs溶解在1L去离子水中，在50 kHz(KH-100dB，中国合创超声)的冰浴中超声处理60min，以获得充分溶解的纳米银溶液。4个处理组分别为：土壤(A)、土壤+100 mg/kg AgNPs(B)、土壤+植物(C)和土壤+植物+100 mg/kg AgNPs(D)，每个处理组有四个重复。每个容器(7 cm×7cm×8 cm)中含有100g土壤，用10mLAgNP原液和40mL去离子水对其进行改良，从而使得每公斤土壤含有100 mg AgNPs。在添加 AgNPs溶液12h后，将黄瓜种子播种到1 cm深的土壤中。在25°C条件下培养7天后，将所得的黄瓜幼苗分栽至每盆一株。然后在昼夜温度分别为28°C和20°C，光周期和暗周期分别为18h和6h的条件下培养幼苗生长60d。其中温室内相对湿度为60%，光照强度为180μmol/(m2s)。在生长期间根据需要给植物浇水，不施用额外的肥料。
实验结果
在AgNPs暴露60d后，对土壤溶解有机质(DOM)的含量、pH和生物可利用元素进行了测定。结果表明AgNPs显著提高了土壤pH值，使没有种植黄瓜的土壤和种植黄瓜的土壤pH分别从5.28提高到5.33和从5.18提高到5.26(图1)。先前的一项研究表明，添加低分子化合物如苹果酸、柠檬酸和甘氨酸会导致土壤pH值显著增加。所以AgNP暴露可能改变了土壤代谢物的组成，随后导致土壤pH值上升。无论植物是否存在，暴露于AgNPs的土壤DOM不发生改变，(图1)。考虑到土壤pH的升高，预计土壤中的水溶性元素会减少。然而在种植黄瓜的土壤中，由于AgNP的存在，所测元素的生物有效性分数显著增加，而且K、Na、Mg、Si等常量元素和Al、Cu、Cd等微量元素也都显著增加(表1)。AgNP驱动这些元素的机制目前尚不清楚，但可能是由于土壤微生物群落和代谢物的变化。
2未种植黄瓜土壤中微生物群落对AgNPs的响应
为了弄清土壤微生物群落对AgNP暴露的响应，在Illumina MiSeq平台上进行了高通量土壤细菌16S rRNA基因测序。数据显示变形菌门、放线菌门、酸杆菌门、绿弯菌门、拟杆菌门和芽单胞菌门是对照组和实验组中的优势类群(图2)。然而主坐标分析的结果(图3)表明，施用AgNP改变了对照组和实验组土壤中细菌群落结构，同时ANOSIM检验结果表明这种变化是显著的(p=0.035)。Sobs指数即每个样本观察到的不同OTU的数量，被用来估计微生物群落的丰富度。与对照组的相比AgNP暴露后导致实验组土壤各分类水平的细菌群落丰度均有显着提高(图4)。此前有文献报道，AgNP暴露后土壤细菌群落丰度增加，具体地说AgNPs暴露增加了与N循环相关的分类群，如亚硝化弧菌属、亚硝化螺菌属和慢生根瘤菌属。还有报道称土壤微生物群落可以通过改变微生物组成以响应AgNP诱导的胁迫，包括增加某些耐银的类群，如红球菌等。当然还有更多的因素可能有助于AgNP暴露后细菌群落丰度的增加，但这需要进一步研究这些变化的潜在机制和由此产生的意义。
如所预料一样，AgNP暴露后大部分微生物受到抑制，只有少部分的微生物丰度会增加(图5I)。例如暴露于AgNPs后，噬几丁质菌属和噬几丁质菌科的相对丰度降低(图5I)。此外与杂多糖水解相关的微生物分类群(Bryobacter)的相对丰度也会减少(图5I)，另一些能通过发酵葡萄糖产生乳酸、丙酸和乙酸的丙酸菌群也对AgNPs呈现负面响应。拟杆菌以能够降解蛋白质和多糖这样的高分子化合物而闻名，但AgNP的暴露也导致这一群体的相对丰度下降(图5I)。由于碳循环相关细菌的相对丰度发生了变化，所以AgNP暴露可能会对土壤微生物体内的糖和有机酸代谢产生负面影响，从而对碳的转移、代谢、储存和土壤有机碳库的组成产生潜在的影响。虽然这些效应的确切机制尚不清楚，但由于Ag+从AgNPs中释放出来会对微生物产生毒性。同时AgNP暴露对土壤中与N循环相关的一些微生物群落也产生了正面或负面的影响。例如Frankiales是一种土壤放线菌，可以与许多植物形成共生根瘤，它们的相对丰度因AgNPs的胁迫而显著下降。但是另一种固氮相关细菌慢生根瘤菌的相对丰度在接触AgNPs后显著增加(图5I)。这与Shah等人的结果一致，他们还观察到，即使AgNP浓度低至0.0625 mg/kg的情况下，慢生根瘤科菌丰度在其胁迫下也会增加。此外另一种与氮循环相关的微生物Arenimonas的相对丰度随着AgNP暴露的增加而增加(图5I)，铁矿沙单孢菌具有碳利用、氮同化和其他重要功能，暴露于AgNP也会使其减少。除了与C和N循环相关的细菌外，AgNP暴露还对环境中参与磷酸盐(P)循环的生物产生影响。AgNPs能够使梭菌目和双生单胞菌的相对丰度分别显著降低和增加(图5I)。梭菌对磷的生物积累、无机磷的溶解和有机磷的矿化都有重要作用。另外AgNP的施用也影响了参与生物和非生物胁迫的微生物。黄单胞菌是已知的植物病原菌，暴露于AgNPs后，其相对丰度显著增加(图5I)。此外，在抑制土传病原体方面发挥有益作用的细菌种群伯克氏菌科也呈现下降的趋势(图5I)。其他值得注意的变化如与污染物降解有关的微生物丰度(诺卡氏菌科、鞘氨醇单胞菌和芽孢球菌)在AgNPs暴露后明显减少。例如诺卡氏菌科可以降解多种有机化合物，包括芳香族和多芳烃污染物以及有毒化学品，鞘氨醇单胞目和鞘氨醇单胞菌科能够有效降解污染土壤中的多环芳烃(PAHs)。综上所述，AgNP暴露改变了参与C、N和P循环，病原菌抗性和污染物降解菌群的相对丰度。土壤生态功能是否受到影响，如C、N、P循环是否受到影响，以及土壤是否更容易受到病原菌增殖的影响，还需要进一步的研究。
3种植黄瓜中土壤中微生物群落对AgNPs的响应
当土壤中有黄瓜植株时，土壤中的优势细菌门为变形杆菌、放线菌、酸杆菌、氯杆菌、拟杆菌和双歧杆菌(图2)，该结果与没有种植黄瓜的土壤中所得结果相同。同时ANOSIM检验结果显示，在种植黄瓜的土壤中，AgNP暴露也显著(p=0.034)改变了土壤微生物群落结构(图3)。综合前面无植物处理的数据，本研究结果表明，无论有无植物存在，AgNP暴露都会显著改变土壤微生物组成。有趣的是，在种植黄瓜的土壤中，土壤微生物群落丰度(Sobs指数)在AgNP暴露后(从门到属)显著降低(图4)，这与未种植黄瓜土壤的情况相反。这可能是由于土壤微生物在植物存在下对AgNP暴露的反应发生了变化，但这种生物相互作用的机制尚不清楚。
与未种植黄瓜土壤相似，AgNPs诱导土壤中的微生物群落发生了一些变化。事实上在植物存在的情况下，AgNPs诱导了类似的微生物变化模式，包括酸杆菌、索氏菌目、短杆菌、噬几丁质菌属、壳聚菌科和索氏菌科亚群的丰度下调，以及黄单胞菌科、黄单胞菌目、双歧单胞菌、铁矿沙单孢菌和慢生根瘤菌的丰度上调(图5Ⅱ）。如上所述，这些物种参与了土壤中碳、氮和磷的循环。因此，AgNPs似乎也可能危害黄瓜种植土壤中的C、N和P循环。这也表明植物只能有限地减轻AgNP暴露对土壤微生物群落的负面影响；但是这些发现与GE等人的研究结果不一致，他们发现大豆植物缓解了CeO2和ZnO对土壤细菌群落的毒性。值得注意的是，鞘氨醇单胞菌目和鞘氨醇单胞菌科是个例外。AgNPs显着降低了未种植黄瓜土壤中的该菌群的相对丰度，但显着增加了种植黄瓜土壤中该菌群相对丰度(图5Ⅱ)。如上所述，植物可以很容易地通过多种途径改变土壤微生物区系，包括将生物活性分子分泌到根际等。
有趣的是，有几个微生物种群丰度只在种植黄瓜的土壤中经历了的变化。这些类群包括绿绿弯菌门(厌氧绳菌纲和绿曲挠茵属)、 变形菌纲(粘球菌目)和吡喃单胞菌目的分类群。它们的相对丰度在暴露于AgNP后均显著降低(图5Ⅱ)。绿弯菌门是一个较大的门，含有具有各种代谢特征的细菌。绿硫菌目由具有细菌叶绿素(BCHL)的缺氧光生菌组成，其中厌氧菌可以通过对碳水化合物的发酵而表现出显著的代谢能力，比如纤维素的水解。此外，变形菌也具有多种功能，包括硫还原，多环芳烃(PAHs)的厌氧降解和铁的还原。此外粘球菌也属于变形菌纲，并且具有能够分解可降解聚合物的能力。因此这些物种的减少表明，即使在植物存在的情况下，AgNP暴露依旧可能会对土壤的碳水化合物代谢和污染物降解产生负面影响。土壤微生物群落，特别是根际微生物群落，通过提供养分获取、抵御病原菌侵染和抗逆性等关键功能，对植物的生长产生深远的影响。因此AgNP暴露引起的土壤微生物群落的显著变化可能会对植物的新陈代谢、生长和抗逆性造成重大风险。
4未种植黄瓜中土壤中土壤代谢物对AgNPs的响应
土壤中的AgNPs可能直接或间接地与土壤微生物相互作用，进而影响土壤微生物的代谢。土壤微生物分泌的胞内和胞外代谢物对土壤代谢物库也会有贡献。因此，监测土壤代谢物可以间接反映微生物代谢过程的变化。采用GC-MS非靶代谢组学方法，对土壤样品中的272种代谢物进行了鉴定和半定量分析。PLS-DA分析结果(图6)显示，没有AgNPs的土壤(A)和有AgNPs的土壤(B)之间有明显的分离。这表明AgNP暴露显著改变了土壤的低分子代谢物分布。由于土壤中的代谢物主要来源于微生物，因此该结果表明AgNPs可能会改变土壤微生物群落内的代谢过程。PLS-DA中变量重要性的度量是VIP(预测中的重要变量)得分。根据参数VIP>1.5，在土壤中鉴定出20种具有重要变异的代谢物(图7I)。如图所示，大多数负责的代谢物在暴露于AgNPs后下降，除了少数上调的代谢物。这说明AgNP暴露总体上对土壤微生物代谢有负面影响。
值得注意的是，随着AgNP暴露，一些脂肪酸及其前体显著减少，包括十五酸、棕榈油酸、亚油酸、棕榈酸、十七酸和油酸(图7I)。微生物可以产生不同链长和组成的磷脂脂肪酸(PLFA)用以维持细胞膜的完整性和细胞功能，以随时应对它们所处的环境条件。PLFA代谢谱的改变可能是由于AgNP能诱导可以氧化微生物细胞膜上脂肪酸的ROS过度产生。或者微生物群落中的群体可能会主动调整他们膜上PLFA，以响应AgNP诱导的压力。另一方面，因为PLFA作为细胞膜成分，在细胞水解过程中会被迅速降解，所以PLFA被用来估计土壤中的活生物量。PLFA水平的降低可能表明AgNPs降低了微生物生物量，PLFA代谢谱的改变也可能是由于土壤中有不同微生物的存在。
其他值得注意的变化包括特定糖和氨基酸的含量。其中半乳糖醇、1,5-脱水葡萄糖醇、1-磷酸果糖、肌醇、葡萄糖-1-磷酸、N-乙酰-D-甘露糖、酮己糖、高丝氨酸、半胱氨酸-甘氨酸和亮氨酸均显著减少或增加(图7I)。半胱氨酸和甘氨酸都是谷胱甘肽的组成部分，谷胱甘肽是微生物中一种重要的抗氧化剂。半胱氨酸和甘氨酸的上调可能表明土壤微生物群落中某些成员的抗氧化防御系统被激活。暴露于AgNPs后，根际土壤中的木聚糖酯含量降低而D-木糖酸内酯则是脱氢酶的直接产物，用单位微生物生物量C的脱氢酶活性来评价微生物的代谢活性。所以D-木糖酸内酯含量的降低可能表明微生物脱氢酶活性降低。此外，暴露于AgNPs后，N-乙酰-D-甘露糖胺和多聚糖的含量也显著降低，据我们所知，微生物产生的生物膜由蛋白质和多糖组成，在细菌群落的形成中发挥着重要作用，有助于维持其结构和功能。所以这种多糖和其他多糖的下调可能再次表明AgNPs对土壤碳循环的负面影响。生物途径分析表明，五条微生物代谢途径发生了显著改变，包括氨基糖和核苷酸糖代谢、淀粉和蔗糖代谢、糖酵解/糖异生、嘧啶代谢和谷胱甘肽代谢(图8)。重要的是，所有这些途径都是与碳代谢相关的途径。这表明AgNP暴露明显影响了微生物的基本代谢过程，尤其是碳代谢，这与前人关于AgNPs会影响土壤微生物代谢从而改变C和N循环的报道基本一致。上述结果表明，土壤代谢组学可以在分子水平上揭示土壤微生物群落对AgNPs或其他外源生物的响应当然也包括毒性机制和后续的解毒策略。
5种植黄瓜中土壤中土壤代谢物对AgNPs的响应
植物能够不断向根际分泌大量代谢物。所以在植物存在的情况下，土壤代谢物库由植物分泌的代谢物和微生物群落的分泌代谢物组成。实验结果表明，在种植黄瓜的土壤中，AgNP暴露也改变了土壤代谢物的分布。如PLS-DA分析结果(图6)所示，土壤+植物+AgNP组(D)与土壤+植物组(C)明显分开。这表明AgNP暴露下的根际代谢物与对照有很大的区别。值得注意的是，一些主要的代谢物与未种植土壤中的代谢物会有相同的部分。例如，在种植黄瓜的土壤中也观察到大量脂肪酸(棕榈油酸、棕榈酸、十七酸和油酸)的显著减少(图7II)。这表明AgNPs对微生物膜的负面影响不会因植物的存在而改变。换言之植物根系分泌物没有显著改变AgNPs对土壤微生物的负面影响。重要的是，有些代谢物的含量只在种植黄瓜的土壤中会发生变化，包括1-酮糖、羊毛甾醇、1-磷酸果糖、槐糖和葡萄糖的含量呈现上升的趋势，而木酸、富马酸、左旋葡聚糖、γ-氨基丁酸、瓜氨酸和β-丙氨酸的含量呈现下降的趋势(图7II)，这表明AgNPs显著改变了根系分泌物的组成。导致这些变化的潜在机制有很多，包括它们是否受到植物的调节，或者变化是主动的还是被动的，但这些仍然不清楚。植物会释放许多物种特有的低分子化合物进入根际，这些具有生物活性的化合物能够影响根际微生物群的活动和组成。在未种植黄瓜的土壤中，微生物群落将直接受到AgNPs的影响。然而在种植黄瓜的土壤中，根系分泌物组成的变化也会间接影响微生物群落。
我们测定了AgNP暴露对黄瓜植株生物量、MDA含量(即脂质过氧化)和抗氧化水平的影响。结果表明AgNPs显著降低了黄瓜组织(根、茎和叶)的生物量(图8I)，表现明显的植物毒性。然而叶绿素含量在AgNP暴露下没有变化(图8II)，AgNP暴露显著(p<0.01)增加了黄瓜叶片中MDA的含量(图8III)，表明黄瓜叶片发生了脂质过氧化。同时在AgNP处理下，黄瓜叶片中的抗氧化剂总酚含量也显著增加(p<0.01)(图8IV)。所以MDA和总酚含量的增加表明AgNPs诱导了黄瓜植株的氧化胁迫。我们先前的研究表明，叶片施用AgNPs也会诱导黄瓜植株的氧化胁迫。具体地说AgNPs释放的Ag离子引发了活性氧的过度生成，这也可能是导致植物氧化胁迫的原因之一。
6植物是否吸收或释放代谢物进入土壤？
据我们所知，植物通过根系分泌作用将大约11−40%的光合作用固定的碳释放到根际。因此与未种植黄瓜的土壤相比，有黄瓜存在的土壤的代谢物含量可能更高。为了区分植物根系释放的代谢物，我们利用PLS-DA模型对A组(土壤)和C组(土壤+植物)的数据进行了分析。结果显示(图6)两种土壤的代谢物剖面有很大的不同。在植物的存在下，几乎所有主要的代谢物都显著增加。这与我们的预期一致，即与微生物相比土壤中植物释放的代谢物贡献了更多的低分子化合物。从VIP评分(图7III)可以看出，有机酸(木酸、柠檬酸、2-羟基戊酸和3-羟基苯甲酸)、糖(槐糖、1，6-二磷酸果糖、葡萄糖-1磷酸、左旋葡聚糖和异麦芽糖)、脂肪酸(油酸和亚油酸)和氨基酸(GABA、缬氨酸、亮氨酸、脯氨酸、苏氨酸、丙氨酸)这些代谢物为土壤微生物群落提供了丰富的碳和能量来源。
原文网址：https://dx.doi.org/10.1021/acs.est.9b07562