科研 | 结合化学、酶法和质谱技术全面分析糖基化蛋白质
糖基化是一种最为常见的蛋白质修饰，对哺乳动物细胞的生存非常重要。这种修饰通常决定蛋白质折叠和运输，调控几乎所有的胞外活动，如细胞-细胞交流和细胞-基质相互作用。蛋白质糖基化异常是人类疾病的特征，比如癌症和感染性疾病。因此，糖基化蛋白质常作为研发药物、疫苗的靶点，或是有效诊断疾病的标志物。但是，对复杂生物样本进行综合、全面的蛋白质糖基化分析十分艰巨。本文中，作者利用基于质谱的bottom-up蛋白质组学技术聚焦糖基化分析。虽然基于质谱的蛋白质组学技术的出现，使得全面分析蛋白质糖基化成为可能，但是低丰度糖基化蛋白质和多糖不均匀性增加了技术分析难度。
原名：Mass Spectromery-Based Chemical and Enzymatic Methods for GlobalAnalysis of Protein Glycosylation
译名：基于质谱的化学和酶法全面分析蛋白质糖基化
期刊：Accounts of Chemical Research
IF： 20.955
发表时间：2018年
通信作者：Ronghu Wu
通信作者单位：School of Chemistry and Biochemistry and the Petit Institute forBioengineering and Bioscience, Georgia Institute of Technology, Atlanta,Georgia 30332, United States.
1基于高效的质谱化学技术全面分析糖基化蛋白质
1.1富集糖基化肽段
由于糖基化蛋白质丰度非常低，在上质谱分析前，必须有高效的糖基化肽段富集方法。常用的富集方法包括凝集素富集，但是该方法不能富集到所有的糖基化肽段；也有亲水作用液相色谱（HILIC），但由于HILIC依赖亲水性差异，因此亲水性的非糖基化肽段不能与糖基化肽段区分，结果特异性较差。
科研人员利用硼酸与糖的可逆作用，开发出基于硼酸的探针检测糖。一个多糖具有多个羟基，硼酸法适用于富集具有多种多糖的糖基化肽段。采用磁珠联结苯硼酸，即可捕获糖基化肽段。在去除非糖基化肽段后，完整的糖基化肽段就会释放到酸性溶液中。
图1 基于硼酸的化学富集法综合分析蛋白质N-糖基化的原理
1.2捕获低丰度糖基化蛋白质
1.2.1硼酸衍生物富集糖基化肽段的效果
虽然理论上基于硼酸的方法能够普遍适用于具有多种多糖的糖基化肽段的捕获，但常用的如苯硼酸与多糖的亲和力比较弱，导致对于捕获低丰度的糖基化肽段/蛋白质的效率较低。
不同硼酸衍生物针对多糖具有不同的亲和力，通过评价硼酸衍生物的性能来判断其富集效果。而其中Benzoboroxole比其它受测试的衍生物性能更突出，与糖的相互作用更强。
图2 不同硼酸衍生物的测试实验
1.2.2协同作用促进糖基化肽段的富集
进一步增强硼酸衍生物和多糖的相互作用能够更有效富集低丰度糖基化蛋白质。基于一个多糖含有多个单糖，且一个单糖连接多个羟基的共有特点，对一个多糖和多个硼酸衍生物分子的协同作用能够促进糖基化肽段的富集。聚合物平台能够结合许多硼酸衍生物分子，同时由于其结构上的灵活性，促进了与多糖之间的协同作用。
研究人员测试了不同大小的与聚合物共轭的硼酸衍生物（DBA），用以最大化富集多糖肽段。当与不含有聚合物的硼酸磁珠进行比较时，DBA能富集到更多的唯一N-糖基化肽段，并且富集过程很快，无糖基化肽段降解或者副作用。
图3 与聚合物共轭的硼酸衍生物协同作用分析
研究人员接着借助DBA方法对酵母细胞、小鼠脑组织中的糖基化蛋白质进行全面的分析，对于N-糖基化，研究人员在酵母中鉴定到501个糖基化蛋白的超过1000个位点；在小鼠脑组织中鉴定到1608个糖基化蛋白质的超过4195个位点。
对人的细胞（MCF7,HEK 293T和Jurkat）,DBA方法的检测对糖基化位点的鉴定率、糖基化蛋白质组的覆盖率有大幅的提升，特别是对于低丰度的糖基化蛋白质。对于三种细胞，鉴定到1906个N-糖基化肽段，4691个位点。蛋白质聚类的结果显示其中的180个糖基化蛋白质只存在于Jurkat细胞，说明大多数糖基化蛋白质具有细胞类型特异性，同时也属于膜蛋白质。
图4 结合DBA方法对人类细胞N-糖基化蛋白质进行综合分析
1.3MassTag的产生用以质谱法全面分析N-糖基化蛋白质
其他类型的修饰，修饰基团都具有固定的结构，而糖基化则不同。糖基化蛋白质中的多糖具有多种结构，导致缺乏通用的Mass Tag用于数据库检索。因此，对糖基化位点产生一个通用的小“标签”，有助于糖基化蛋白质的位点特异性鉴定。
在实际科研中，常用酶法在N-糖基化位点上产生Mass Tag。如PNGase F广泛用于去除N-多糖，从而在糖基化位点留下标签用于质谱分析。此外，内糖苷酶也常用于在N-糖基化位点生成通用标签。然而，没有任何一种酶能够对所有具有多种多糖的N-糖基化肽段形成通用的标签。
由于N-多糖有着通用的核心结构，并且第一根健连向肽段（酰胺键），剩余的都在糖之间连接（糖苷键）。因此，研究人员第一次采用化学法去糖基化来产生能全面分析N-糖基化肽段的通用标签。
通过三氟甲磺酸（TFMS）切断糖苷键，去除外层的糖，保留了最内层的GlcNAc，而去糖基化的肽段再用质谱进行分析。虽然化学法去糖基化产生的标签与Endo H相同，但却能更好地鉴定N-糖基化位点和N-糖基化蛋白质。
图5 化学去糖基化切断糖苷键但保留酰胺键的原理图
2.靶向分析位于细胞表面的糖基化蛋白
细胞表面蛋白质对于很多细胞活动十分重要，它们中的大多数被糖基化。全面、特异性的分析只存于细胞表面的蛋白质非常困难，随着化学生物学和质谱蛋白质组学技术的发展，近几年对其的综合分析才变得可行。本文中研究人员开发出了代谢标记和基于点击化学的方法用于分析细胞表面糖基化蛋白质。
2.1结合点击化学和酶促反应靶向分析细胞表面糖基化蛋白质
近年来，含有生物正交功能基团的非天然糖整合入糖基化蛋白质。结合生物正交化学，糖基化蛋白质在生物系统中的功能得到了更好的研究。研究人员通过整合代谢标记、无铜化点击化学、酶促反应及基于质谱的蛋白质组学技术全面、位点特异性的分析细胞表面的糖基化蛋白质组。
同样的，一种含有叠氮基的糖类似物用于标记糖基化蛋白质，包括表面糖基化蛋白质。随后，细胞表面带有功能基团的糖基化蛋白质加上了DBCO-硫基-生物素标签。在完成蛋白质提取、消化后，带有生物素标签的糖基化肽段用中性抗生素蛋白磁珠进行富集，接着再用PNGase F对富集的肽段进行去糖基化。按照这种方法，研究人员从HEK293T细胞中鉴定到110个蛋白质的152个N-糖基化位点，并且95%都是膜蛋白质。研究人员进一步对不同的糖类似物进行测试，发现GalNAz标记能鉴定到最多数量的表面N-糖基化蛋白质。
2.2全面且位点特异性分析细胞表面唾液糖蛋白
细胞表面的唾液糖蛋白可能显著影响细胞特性，反映不同的细胞状态，用糖类似物进行代谢标记是研究唾液糖蛋白非常有效的方法。
研究人员整合代谢标记、点击和酶促反应、基于质谱的蛋白质组学技术全面且位点特异性的分析细胞表面的N-唾液糖蛋白。并通过显微镜成像、凝胶电泳技术来检测细胞表面唾液糖蛋白的标记效率。当用质谱进行分析后，在HEK 293T细胞中检测到274个表面蛋白含有395个唯一N-唾液糖基化位点。
图6 N-唾液糖蛋白的分析原理及标记效率检测图
该方法也可以用于分泌蛋白质组和细胞裂解物中唾液糖蛋白的分析。在分泌蛋白质组中，定位到78个N-唾液糖蛋白的128个位点；细胞膜系统中鉴定到482个蛋白质的1120个N-唾液糖基化位点。蛋白质聚类分析的结果显示种类最多的蛋白具有受体活性（35%），随后依次有催化活性、连接活性和运输活性，这些都是已知的表面糖蛋白质的功能。
图7 分泌蛋白质组和细胞裂解物中唾液糖蛋白质的分析
3.糖基化蛋白质和细胞表面糖基化蛋白质动态变化的系统性定量
3.1细胞表面糖基化蛋白质的定量
研究人员利用SILAC标记结合前面所叙述的方法，对细胞表面糖基化蛋白质进行系统性定量分析。结果显示当用他汀对Hep G2细胞进行处理时，细胞表面蛋白许多糖基化位点下调，从而会导致细胞属性改变。
3.2细胞表面糖基化蛋白动态变化的系统性分析
细胞为了适应外界环境的变化，其表面糖基化蛋白质往往呈现动态变化。除了之前描述的鉴定细胞表面糖蛋白的难点外，系统性定量其丰度变化也是巨大的挑战。最近，研究人员通过结合脉冲追踪标记、表面糖基化蛋白质标签和多元蛋白质组学选择性富集技术用以研究细胞表面糖蛋白的动态变化。
图8 研究细胞表面糖蛋白动态变化及其半衰期测定的流程图
最终，通过离子强度分析糖基化肽段的丰度，定量到248个表面糖蛋白，并且计算出了它们的半衰期。而具有催化活性的表面糖蛋白，比具有连接活性和受体活性的更稳定。
本文作者针对较难研究的糖基化蛋白质组学，通过特定的糖基化肽段富集方法、点击化学、酶促反应结合质谱蛋白质组学分析，探讨了人细胞表面糖基化蛋白质的定性、定量及动态变化，对于疾病发生发展的研究具有一定的指导意义。